SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI

Ngày nay với tốc độ phát triển như vũ bão của khoa học và công nghệ đã kéo theo hàng loạt những thay đổi trong đời sống xã hội của con người: kinh tế, chính trị, xã hội,… rồi đến đời sống vật chất, tinh thần,… Thông qua đó đặt ra một vấn đề hết sức cấp thiết làm sao giải quyết tốt vấn đề lương thực thực phẩm cho con người. Thực tế cho thấy việc áp dụng thành công trong khoa học – công nghệ vào sản xuất nông nghịêp nhằm nâng cao năng xuất cây trồng đã...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TRẦN NHƢ NGỌCSỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPSỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC KHÓA: 28 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ***000*** RFLP ANALYSIS OF POLYMORPHISMS INMetarrhizium anisopliae AND Beauveria bassiana ACCOSIATED WITH INSECT GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY PROFESSOR STUDEN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC TERM: 28 HCMC 9/2006 LỜI CẢM TẠXin chân thành gửi lời cảm tạ đến:  Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi.  ThS. Võ Thị Thu Oanh đã hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực tập và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  TS. Bùi Minh Trí –Trưởng trung tâm phân tích Hóa – Sinh trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Phòng thí nghiệm Hóa – Sinh thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm.  Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh, đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Hưng đã hết lòng giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.  Các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105 – khu Phượng Vĩ Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền củahai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana” ký sinh trên côn trùnggây hại ” được thực hiện từ ngày 20 tháng 2 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005tại trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài do Trần Như Ngọc thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS. Võ Thị ThuOanh Đối tượng nghiên cứu là nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveriabassiana ký sinh trên côn trùng gây hại. Nấm này có tác dụng tiết ra độc tố làm ngừnghoạt động của ruột, phá vở các hoạt động bình thường của côn trùng dẫn đến côn trùngbị chết khô Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr1 của những dòng nấmMetarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassianagiúp chọn lọc đúng những dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassianacó tính độc đảm bảo hoạt tính diệt côn trùng lâu dài và hiệu quả nhằm phục vụ cho sảnxuất nông nghiệp . Các nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Phục hồi các chủng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiantrên một số côn trùng gây hại . 2. Dùng kỹ thuật PCR phát hiện gen protease (Pr1) và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 liên quan đến tính độc của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana.. 3. Sau khi thöïc hieän phaûn öùng PCR ta söû duïng kỹ thuật RFLP thực hiện phaûn öùngenzyme caét giôùi haïn ñeå phaùt hieän söï ña hình trong phaïm vi vuøng IST1-5.8S-IST2 cuûa naámBeauveria bassiana vaø vuøng Pr1 cuûa naám Metarrhizium anisopliae 4. Giải trình tự đoạn gen Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 so sánh trình tự nàyvới các mẫu trên ngân hàng gen thế giới (genbank). Kết quả thu được như sau: 1.Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trên môi PGA: Sau quá trình phục hồi các nguồn nấm trên môi trường PGA(Potato-Glucose-Agar),kết quả chúng tôi đã thu được một số dòng nấm sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy :RNBT1.7 ,DONG 3.1, BXĐTG6, RMTĐ3 ,PULQ2, NNPT7, SR, BRVT6 ,BHBD6,SCLLLA1, BDTN4 ,BDQ96 . 2.Nhân sinh khối các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trong môi trườnglỏng Czapek – Dox trong khoảng thời gian từ 3-5 ngày , thu được sinh khối nấm ,rửalại với nước cất rồi phơi khô , nghiền trong nitơ lỏng ,cuối cùng chúng tôi được nấm ởdạng khô và chúng tôi bảo quản nấm -800C cho đến khi sử dụng . 3.Tiến hành ly trích nấm đã bảo quản ở trên bằng dịch ly trích ,kết quả tríchđược DNA của 12 dòng nấm Metarrhizium và Beauveria ,sau đó là tinh sạch DNA củacác dòng nấm Metarrhizium và Beauveria nhằm tạo sản phẩm sạch ,ít tạp trong sảnphẩm PCR.Sau tinh sạch vẫn giữ được DNA của 12 mẫu nấm. 4.Thực hiện phản ứng PCR trên các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria , kếtquả thu được sản phẩm PCR của 6 dòng nấm Beauveria 5.Phân tích RFLP , thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn trên 6dòng nấm Be ...