Tách dòng phân tử và xây dựng thư viện hệ gen

Tách dòng phân tử (molecular cloning) là khái niệm chỉ một nhóm các phương pháp được sử dụng để: i) phân lập một một trình tự gen (ADN) đặc hiệu từ hỗn hợp các phân tử ADN ban đầu được tách chiết từ các mẫu sinh học vốn có cấu trúc phức tạp, kích thước lớn; và ii) khuếch đại (sao chép) trình tự lên một số lượng lớn đủ để có thể tiến hành phân tích về cấu trúc và chức năng của gen tương ứng....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tách dòng phân tử và xây dựng thư viện hệ gen Tách dòng phân tử và xây dựng thư viện hệ genTách dòng phân tử (molecular cloning) làkhái niệm chỉ một nhóm các phươngpháp được sử dụng để: i) phân lập mộtmột trình tự gen (ADN) đặc hiệu từ hỗnhợp các phân tử ADN ban đầu được táchchiết từ các mẫu sinh học vốn có cấutrúc phức tạp, kích thước lớn; và ii)khuếch đại (sao chép) trình tự lên mộtsố lượng lớn đủ để có thể tiến hànhphân tích về cấu trúc và chức năng củagen tương ứng.Khả năng tinh sạch các đoạn gen (ADN)đặc hiệu có số lượng đủ lớn là cần thiếtđể có thể “thao tác” các đoạn gen đó vìcác mục tiêu nghiên cứu khác nhau.Chẳng hạn, từ các phân đoạn ADNđược tách dòng, người ta có thể tạo racác phân tử ADN tái tổ hợp mang cácphân đoạn ADN mang nguồn gốc khácnhau. Các phân tử ADN tái tổ hợp mớicó thể làm thay đổi mức độ biểu hiệnbình thường của một gen (chẳng hạnbằng việc dung hợp giữa một trình tựmã hóa của một loài này với trình tựpromoter của một loài khác) hoặc thậmchí mã hóa tổng hợp một loại protein“dung hợp” mới (protein lai) mang cáctrình tự axit amin từ các protein có nguồngốc khác nhau. Hiện nay, các kỹ thuậttách dòng phân tử (bao gồm cả PCR) đãtrở thành các công cụ thiết yếu trongnghiên cứu về sự điều hòa và biểu hiệncủa các gen và hệ gen ở các loài sinh vậtkhác nhau.Quá trình tách dòng ADN và tạo nên cácphân tử ADN tái tổ hợp điển hìnhthường liên quan đến việc sử dụng cácvéctơ là trình tự mang thông tin điềukhiển hoạt động nhân lên (khuếch đại)và/hoặc biểu hiện trong tế bào của phântử ADN tái tổ hợp mang đoạn ADN cài(đoạn trình tự được phân lập) bao gồmtrình tự gen được quan tâm nghiên cứu.Các “công cụ” chính để tạo nên các phântử ADN tái tổ hợp là các enzym giới hạngiúp cắt các phân tử ADN tại các vị tríxác định và các enzym nối cho phép ghépnối các phân đoạn ADN có nguồn gốckhác nhau với nhau. Bằng việc tạo nêncác phân tử ADN tái tổ hợp có thể tựnhận lên trong tế bào chủ, một đoạnADN cài xác định nào đó có thể đượcphân lập, tinh sạch và nhân lên thànhmột số lượng lớn các bản sao.Tiếp theo đây, chúng ta sẽ mô tả bằngcách nào các phân tử ADN được cắt, táitổ hợp và nhân lên, đồng thời đề cậpđến việc xây dựng thư viện hệ gen gồmtập hợp các phân tử ADN lai chứa cácđoạn cài xuất phát từ một hệ gen cầnđược thiết lập để phục vụ cho việcnghiên cứu, phân tích một hệ gen. Thôngthường một thư viện hệ gen được thiếtlập bằng việc sử dụng chung cùng mộtloại véctơ mang các phân đoạn ADN càikhác nhau. Chúng ta sẽ thấy bằng cáchnào các phân đoạn ADN đặc hiệu có thểđược xác định và phân lập từ các thưviện hệ gen.Tách dòng ADN trong các véctơ plasmitSau khi một phân đoạn ADN được cắtkhỏi một phân tử ADN có kích thướclớn hơn bằng enzym giới hạn, phânđoạn ADN đó cần được “cài” vào mộtvéctơ để có thể nhân lên. Hay nói cáchkhác là một phân đoạn ADN cần đượccài vào một phân tử ADN thứ hai (véctơ)để có thể nhân lên được trong tế bàochủ như đã nói ở trên. Cho đến nay, tếbào chủ được sử dụng rộng rãi nhất đểnhân lên các đoạn ADN trong công nghệADN tái tổ hợp là vi khuẩnE. coli.Các véctơ ADN điển hình thường có 3đặc tính:1) Chúng phải chứa một trình tự khởiđầu sao chép (tái bản), cho phép chúngtự sao chép độc lập với nhiễm sắc thểcủa tế bào chủ.2) Chúng phải mang một dấu chuẩnchọn lọc cho phép dễ dàng xác định vàphân lập được các tế bào mang véctơ táitổ hợp (mang đoạn ADN cài) với các tếbào không mang véctơ tái tổ hợp.3) Có vị trí cắt của một hoặc nhiềuenzym giới hạn khác nhau. Đây chính làvị trí cài của phân đoạn ADN cần táchdòng vào véctơ.Véctơ tách dòng phổ biến nhất là cácphân tử ADN sợi kép, mạch vòng kíchthước nhỏ (khoảng 3 kb) được gọi làcác plasmit. Các véctơ này phần lớn cónguồn gốc từ các loài vi khuẩn và mộtsố từ các sinh vật nhân chuẩn đơn bào(nấm men). Trong nhiều trường hợp, cácphân tử ADN này trong tự nhiên đã mangsẵn các gen mã hóa tính kháng chấtkháng sinh. Như vậy, các plasmid trongtự nhiên đã có sẵn hai thuộc tính là: khảnăng tự sao chép trong tế bào chủ và cótrình tự dấu chuẩn chọn lọc. Ngoài ra,các véctơ plasmit còn một ưu điểm nữalà chúng có thể đồng thời tồn tại nhiềubản sao trong tế bào. Điều này có thểgiúp khuếch đại và phân lập được mộtsố lượng lớn một phân đoạn ADN nàođó từ một quần thể tế bào nhỏ.Trước đây, một số véctơ plasmit chỉ cómột vị trí cắt của enzym giới hạn duynhất. Cùng với thời gian, cấu trúc củacác véctơ plasmit được cải tiến theohướng cắt bỏ bớt các trình tự không cầnthiết và gắn thêm vào đoạn trình tự cóthể được cắt bằng nhiều loại enzymgiới hạn khác nhau. Vị trí trên véctơmang đoạn trình tự như vậy được gọi làvị trí đa tách dòng (polycloning site). Cónhững vị trí đa tách dòng hiện nay cókích thước ngắn nhưng có thể được cắtbởi trên 20 loại enzym giới hạn khácnhau. Nhờ đặc tính này, một véctơ cóthể được dùng để tách dòng nhiều phânđoạn ADN có nguồn gốc khác nhau.Trên cơ sở các nguyên tắc tương tự, ...