Tạo dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa protein RHO liên quan đến cơ chế thực bào ở tôm sú (Penaeus monodon)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi lần đầu tiên tiến hành phân lập đoạn gen Rho từ mẫu mô gan tôm sú bị bệnh đốm trắng. Để khuếch đại một phần đoạn gen Rho bằng kỹ thuật RT - PCR, cặp mồi suy diễn được thiết kế dựa trên trình tự amino acid bảo thủ của protein Rho ở một số loài đã biết. Sau đó, sản phẩm RT-PCR được tạo dòng trong vector pCR2.1 và tiến hành xác định trình tự. Trình tự đoạn gen Rho thu được có kích thước 272 bp, mã hóa 90 amino acid.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tạo dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa protein RHO liên quan đến cơ chế thực bào ở tôm sú (Penaeus monodon)Hoàng Thị Thu Yến và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ96(08): 145 - 150TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN RHOLIÊN QUAN ĐẾN CƠ CHẾ THỰC BÀO Ở TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)Hoàng Thị Thu Yến1*, Kim Thị Phương Oanh2, Nông Văn Hải221Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái nguyênViện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt NamTÓM TẮTProtein Rho là một thành viên thuộc siêu họ Ras, protein này thực hiện chức năng liên quan đến cơchế thực bào, một cơ chế miễn dịch chính ở tôm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lần đầu tiên tiếnhành phân lập đoạn gen Rho từ mẫu mô gan tôm sú bị bệnh đốm trắng. Để khuếch đại một phầnđoạn gen Rho bằng kỹ thuật RT - PCR, cặp mồi suy diễn được thiết kế dựa trên trình tự aminoacid bảo thủ của protein Rho ở một số loài đã biết. Sau đó, sản phẩm RT-PCR được tạo dòng trongvector pCR2.1 và tiến hành xác định trình tự. Trình tự đoạn gen Rho thu được có kích thước 272bp, mã hóa 90 amino acid. Trình tự nucleotide đoạn gen Rho được đăng ký trên Genbank với mãsố JN617867. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi góp phần tạo nguyên liệu nghiên cứu cấu trúc genRho hoàn chỉnh, từ đó phục vụ nghiên cứu chức năng của protein Rho.Từ khóa: Tôm sú, protein Rho, thực bào, gen liên quan đến miễn dịch, protein siêu họ RasMỞ ĐẦU*Thực bào là cơ chế miễn dịch tế bào chính ởtôm, liên quan đến sự thu nhận các vật thể lạtừ bên ngoài. Cơ chế này được thực hiện bởibạch cầu bán hạt và bạch cầu hạt. Quá trìnhthực bào bao gồm các bước: hướng hóa, bámchặt, tiêu hóa, phá hủy tác nhân gây bệnh vàxuất bào [5], [10]. Quá trình thực bào ở độngvật không xương sống nói chung và tôm nóiriêng tương tự như ở động vật có xương sống.Tuy nhiên, sự tiếp xúc miễn dịch luôn đượcthực hiện có tính ngẫu nhiên, rất hiếm chủđộng theo kiểu hóa hướng động ở động vật cóxương sống [1]. Ngoài ra, bạch cầu bán hạt cókhả năng nhận biết các tác nhân xâm nhập vàhoạt động như là một sự opsonins hóa kết hợpvới hệ thống hoạt hóa proPO [8].Protein Rho là một thành viên thuộc siêu họRas (Ras superfamily). Hầu hết các nghiêncứu của các protein Ras về hoạt tính miễndịch tập trung vào sự điều khiển cơ chế thựcbào bởi Rho GTPase [4] và các nhân tố chịutác động của Rho ảnh hưởng đến sự điềuchỉnh vận động của actin trong quá trình thựcbào ở động vật có vú [3]. Ở tôm thẻ Nhật Bản(Marsupenaeus japonicus), nghiên cứu sosánh sự biểu hiện gen giữa tôm kháng virusWSSV với tôm thường cho thấy: các gen*Tel: 0912 896298, Email: yenhtt79@gmail.comRan, Rho và Rab biểu hiện tăng đáng kể ởtôm kháng virus. Đây là bằng chứng chứng tỏnhững GTPase này tham gia vào quá trìnhtruyền tín hiệu trong phản ứng bảo vệ ở tôm[6]. Ngoài ra, khi xây dựng thư viện EST tômsú Tassanakajon và đtg (2006) đã chỉ ra: khitôm sú ở trong điều kiện stress nhiệt độ (heatstress), gen Rho ở mô máu của tôm sú đượcbiểu hiện tăng [9]. Đến nay, gen Rho từ tômsú (Penaeus monodon) vẫn chưa được phânlập. Do đó, để góp phần nghiên cứu cấu trúcvà chức năng của protein này, bước đầuchúng tôi tiến hành tạo dòng và xác định trìnhtự một phần đoạn gen Rho (gọi tắt là đoạngen Rho) từ mẫu tôm sú Việt Nam.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNguyên liệuChúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu tôm bịbệnh đốm trắng tại Trạm Nghiên cứu thủy sảnnước lợ, km10 đường cao tốc Hải Phòng - ĐồSơn và các đầm nuôi tư nhân vùng lân cận.Ngay sau khi nhận tôm nguyên con, mô ganđã được tách riêng và bảo quản trong dungdịch nitơ lỏng.Phương phápTách chiết RNA tổng số, tinh sạch mRNA vàtổng hợp cDNAPhương pháp tách chiết RNA tổng số, tinhsạch mRNA và tổng hợp cDNA cho phản ứng145Hoàng Thị Thu Yến và ĐtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆRT-PCR được tiến hành theo mô tả củaHoàng Thị Thu Yến và đtg [2]. Phản ứng 3’và 5’RACE (Rapid Amplification of cDNAEnds) được thực hiện theo kit “SMARTer™RACE cDNA Amplification Kit”(Invitrogen).Nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCRDựa trên thông tin trình tự amino acid củaprotein Rho của một số loài đã công bố,chúng tôi thiết kế mồi suy diễn Rho DPF vàRho DPR (DP-degenerate primer) (Hình 1,Bảng 1). Sau đó sử dụng cặp mồi này thựchiện phản ứng RT-PCR theo kit “SuperScript.First-Strand Synthesis System for RT-PCR”(Invitrogen).96(08): 145 - 150Trình tự của gen được đọc ở 2 dòng plasmidtái tổ hợp và đọc một chiều. Kết quả trình tựgen được phân tích, so sánh bằng phần mềmsinh học chuyên dụng (Sequence Scanner,BLAST, Bioedit)KẾT QUẢTách dòng đoạn gen RhoDựa trên cơ sở so sánh trình tự amino acidcủa protein Rho ở một số loài đã công bố trênGenBank như tôm he Nhật Bản(Marsupenaeus japonicus; HM581521), muỗi(Anopheles gambiae; XP_001688510), ruồigiấm(Drosophilamelanogaster;NP_995851),ong(Apismellifera;XP_393401), sâu (Saccoglossus kowalevskii;XM_002741555),cá(Daniorerio;NP_998302), Frog - ếch (Xenopus laevis;NP_001088626)… chúng tôi thiết kế cặp mồ ...