TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ELISA

Đặt vấn đề: Ngộ độc thực phẩm hiện nay liên quan nhiều rất sự ô nhiễm Staphylococcus aureus và độc tố của chúng gây ra trong những năm gần đây. Do đó thiết lập qui trình ELISA để phát hiện độc tố là một nhu cầu cần thiết hiện nay.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ELISA TẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ELISA TÓM TẮT Đặt vấn đề: Ngộ độc thực phẩm hiện nay liên quan nhiều rất sự ô nhiễmStaphylococcus aureus và độc tố của chúng gây ra trong những năm gần đây. Do đóthiết lập qui trình ELISA để phát hiện độc tố là một nhu cầu cần thiết hiện nay. Mục tiêu nghiên cứu: Tạo kháng thể đa dòng và khảo sát các thông số kỹthuật của qui trình ELISA sandwich xây dựng bộ kít phát hiện độc tố ruột nhóm Acủa Staphylococcus aureus. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng các kỹ thuật gây miễn dịch trên thỏ thunhận kháng thể, kỹ thuật tinh chế kháng thể và cộng hợp kháng thể để làm nguyên vậtliệu cho nghiên cứu qui trình kỹ thuật ELISA sandwich phát hiện độc tố ruột nhóm Acủa Staphylococcus aureus. Kết quả nghiên cứu: Kháng thể sau khi gây miễn dịch trên thỏ được tinh chếvà thu được 700 l, với nồng độ 16860 g/ml. Kháng thể này được cộng hợp vớienzym HRP, và sử dụng để thực hiện quy trình ELISA sandwich với độ pha loãng là3.200 lần trong PBS buffer. Các thông số của qui trình ELISA sandwich đối với độctố ruột nhóm A là: - Quá trình phủ giếng + Dung dịch phủ giếng là Carbonate bufferpH 9,5. + Nồng độ kháng thể kháng độc tố A phủ giếng là 5 g/ ml. + Ủ ở nhiệt độphòng trong 3 giờ. - Quá trình khóa giếng. + Khóa giếng bằng sữa gầy 1%. + Ủ ở 4oCtrong 30 phút. - Quá trình ủ với độc tố + Độc tố được pha loãng trong PBS buffer. +Ủ ở 37oC trong 2 giờ. - Quá trình ủ với kháng thể thứ cấp. + Kháng thể đánh dấuHRP được pha loãng 1/3.200 trong PBS buffer. + Ủ ở 25oC trong 1 giờ. - Đọc kếtquả: Đọc kết quả bằng dung dịch phát màu 2,2’-azino-di (3-ethyl-benzonthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) ở bước sóng 405nm. - Đánh giá các thông số kỹ thuật củaphương pháp mới so với phương pháp tham chiếu với kết quả: độ nhạy 100%, độ đặchiệu 93%, tỷ lệ âm tính giả 0%, tỷ lệ dương tính giả 6,25% và độ tương đồng của thửnghiệm là 95,5% Kết luận: Bộ kit có thể dùng để phát hiện độc tố ruột nhóm A củaStaphylococcus aureus.. ABSTRACT PRODUCTION OF POLYCLONAL ANTIBODIES AND SET UP THEELISA PROCEDURE TO DETECT STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN A Nguyen Do Phuc, Trần Linh Thước, et al * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 12 - Supplement of No 4 - 2008: 272 - 277 Background: Enterotoxins produced by Staphylococcus aureus areresponsible for staphylococcal food –poisoning outbreaks in recently. Establishing theELISA procedure is needed to detect staphylococcal enterotoxin A in controllingpoisoning outbreaks in Viet Nam. Objectives: Production polyclonal antibodies and surveying the technicalparameters of the sandwich ELISA procedure to detect staphylococcal enterotoxin A. 1. Viện Vệ sinh - Y tế Công Cộng thành phố Hồ Chí Minh 2. Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh Method: Antiserum to staphylococcal enterotoxin A (SEA) is colected fromimmunized rabbit and purification of polyclonal IgG antibodies from this serum byusing a staphylococcal protein A column. This purified antibodies is used forsandwich ELISA procedure. Results: Polyclonal antibody after immunization in Rabbit was purified with g/ml (700 l). The antibody was conjugated with HRP enzymeantibody titer 16860Which used for surveying the technical parameters of ELISA procedure with resultsfollowing: Coating plate + Coating solution is Carbonate buffer pH 9.5. + Antibody g/ ml. + Room temperature in 3 h. - Bloking plate Blokingtiter coating is 5solution is skim milk 1% + Keep at 4oC in 30 minutes. - Incubation with enterotoxin+ Room temperature in 2 h. - Incubation with HRP-antibody + HRP-antibody wasdiluted 1/3,200 in PBS buffer. + Keep at 25oC in 1 h. - Read result: at = 405nm withABTS. - When compared to the reference method, the criteria of new mehtod meet:sensitivity 100%, specificity 93%, false negative 0%, false positive 6.25% and testEfficacy 95.5%. Conclusion: ELISA kit can use to detect staphylococcal enterotoxin A. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong các chỉ tiêu về vi sinh thực phẩm, Staphylococcus aureus là một trongnhững vi khuẩn thường gây ra ô nhiễm thực phẩm và là nguyên nhân của những vụngộ độc thực phẩm. Ðể có thể kết luận nguyên nhân vụ ngộ độc do Staphylococcusaureus bên cạnh việc phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn, cần phải xác định sự hiệndiện của độc tố ruột mới là nguyên nhân chính, đến nay vẫn chưa được triển khai ápdụng. Chính vì điều đó chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu qui trình sản xuất và tinh tếkháng thể đa dòng được gây miễn dịch trên thỏ nhằm tạo các nguyên vật liệu ban đầuđể khảo sát và hòan thiện các thông số của qui trình ELISA dùng để phát hiện độc tốruột nhóm A và nhằm góp phần trong công tác kiểm tra, giám sát ngộ độc thực phẩmdo độc tố ru ...