Tạo kháng thể đa dòng và xây dựng qui trình elisa phát hiện độc tố ruột nhóm A của staphylococcus aureus

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm tạo kháng thể đa dòng và khảo sát các thông số kỹ thuật của qui trình elisa sandwich xây dựng bộ kít phát hiện độc tố ruột nhóm A của staphylococcus aureus. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tạo kháng thể đa dòng và xây dựng qui trình elisa phát hiện độc tố ruột nhóm A của staphylococcus aureusTẠO KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ELISAPHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RUỘT NHÓM ACỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUSNguyễn Đỗ Phúc1, Nguyễn Thị Kê1, Trần Linh Thước2 và CsTÓM TẮTĐặt vấn đề: Ngộ độc thực phẩm hiện nay liên quan nhiều rất sự ô nhiễm Staphylococcus aureus và độc tốcủa chúng gây ra trong những năm gần đây. Do đó thiết lập qui trình ELISA để phát hiện độc tố là một nhu cầucần thiết hiện nay.Mục tiêu nghiên cứu: Tạo kháng thể đa dòng và khảo sát các thông số kỹ thuật của qui trình ELISAsandwich xây dựng bộ kít phát hiện độc tố ruột nhóm A của Staphylococcus aureus.Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng các kỹ thuật gây miễn dịch trên thỏ thu nhận kháng thể, kỹ thuật tinhchế kháng thể và cộng hợp kháng thể để làm nguyên vật liệu cho nghiên cứu qui trình kỹ thuật ELISA sandwichphát hiện độc tố ruột nhóm A của Staphylococcus aureus.Kết quả nghiên cứu: Kháng thể sau khi gây miễn dịch trên thỏ được tinh chế và thu được 700µl, với nồngđộ 16860 µg/ml. Kháng thể này được cộng hợp với enzym HRP, và sử dụng để thực hiện quy trình ELISAsandwich với độ pha loãng là 3.200 lần trong PBS buffer. Các thông số của qui trình ELISA sandwich đối với độctố ruột nhóm A là: - Quá trình phủ giếng + Dung dịch phủ giếng là Carbonate buffer pH 9,5. + Nồng độ khángthể kháng độc tố A phủ giếng là 5 µg/ ml. + Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ. - Quá trình khóa giếng. + Khóa giếngbằng sữa gầy 1%. + Ủ ở 4oC trong 30 phút. - Quá trình ủ với độc tố + Độc tố được pha loãng trong PBS buffer. +Ủ ở 37oC trong 2 giờ. - Quá trình ủ với kháng thể thứ cấp. + Kháng thể đánh dấu HRP được pha loãng 1/3.200trong PBS buffer. + Ủ ở 25oC trong 1 giờ. - Đọc kết quả: Đọc kết quả bằng dung dịch phát màu 2,2’-azino-di (3ethyl-benzonthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) ở bước sóng 405nm. - Đánh giá các thông số kỹ thuật củaphương pháp mới so với phương pháp tham chiếu với kết quả: độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 93%, tỷ lệ âm tính giả0%, tỷ lệ dương tính giả 6,25% và độ tương đồng của thử nghiệm là 95,5%Kết luận: Bộ kit có thể dùng để phát hiện độc tố ruột nhóm A của Staphylococcus aureus..ABSTRACTPRODUCTION OF POLYCLONAL ANTIBODIES AND SET UP THE ELISA PROCEDURETO DETECT STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN ANguyen Do Phuc, Trần Linh Thước, et al* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 12 - Supplement of No 4 - 2008: 272 - 277Background: Enterotoxins produced by Staphylococcus aureus are responsible for staphylococcal food –poisoning outbreaks in recently. Establishing the ELISA procedure is needed to detect staphylococcal enterotoxinA in controlling poisoning outbreaks in Viet Nam.Objectives: Production polyclonal antibodies and surveying the technical parameters of the sandwichELISA procedure to detect staphylococcal enterotoxin A.Method: Antiserum to staphylococcal enterotoxin A (SEA) is colected from immunized rabbit andpurification of polyclonal IgG antibodies from this serum by using a staphylococcal protein A column. This1. Viện Vệ sinh - Y tế Công Cộng thành phố Hồ Chí Minh2. Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minhpurified antibodies is used for sandwich ELISA procedure.Results: Polyclonal antibody after immunization in Rabbit was purified with antibody titer 16860 µg/ml(700µl). The antibody was conjugated with HRP enzyme Which used for surveying the technical parameters ofELISA procedure with results following: Coating plate + Coating solution is Carbonate buffer pH 9.5. + Antibodytiter coating is 5 µg/ ml. + Room temperature in 3 h. - Bloking plate Bloking solution is skim milk 1% + Keep at4oC in 30 minutes. - Incubation with enterotoxin + Room temperature in 2 h. - Incubation with HRP-antibody +HRP-antibody was diluted 1/3,200 in PBS buffer. + Keep at 25oC in 1 h. - Read result: at λ= 405nm with ABTS. When compared to the reference method, the criteria of new mehtod meet: sensitivity 100%, specificity 93%, falsenegative 0%, false positive 6.25% and test Efficacy 95.5%.Conclusion: ELISA kit can use to detect staphylococcal enterotoxin A.ĐẶT VẤN ĐỀTrong các chỉ tiêu về vi sinh thực phẩm, Staphylococcus aureus là một trong những vikhuẩn thường gây ra ô nhiễm thực phẩm và là nguyên nhân của những vụ ngộ độc thựcphẩm. Ðể có thể kết luận nguyên nhân vụ ngộ độc do Staphylococcus aureus bên cạnh việcphát hiện sự hiện diện của vi khuẩn, cần phải xác định sự hiện diện của độc tố ruột mới lànguyên nhân chính, đến nay vẫn chưa được triển khai áp dụng. Chính vì điều đó chúng tôiđặt vấn đề nghiên cứu qui trình sản xuất và tinh tế kháng thể đa dòng được gây miễn dịchtrên thỏ nhằm tạo các nguyên vật liệu ban đầu để khảo sát và hòan thiện các thông số củaqui trình ELISA dùng để phát hiện độc tố ruột nhóm A và nhằm góp phần trong công táckiểm tra, giám sát ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột (enterotoxin) của Staphylococcus aureusgây raMục tiêu nghiên cứu- Gây đáp ứng miễn dịch độc tố ruột nhóm ...