Thí nghiệm Sinh học phân tử - THS. Nguyễn Thị Lan

Để tiến hành tách ADN từ tế bào thì ta phải tiến hành phá bỏ màng tế bào và màng nhân, sau đó biến tính protein để loại bỏ lượng protein chứa trong dịch tách, loại bỏ ARN và sau cùng kết tủa ADN bằng cồn.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thí nghiệm Sinh học phân tử - THS. Nguyễn Thị LanThí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan BÀI MỞ ĐẦU: MÔ PHỎNG THÍ NGHIỆM 1. Mô phỏng điện di protein trên điện di đứng. 2. Mô phỏng điện di protein bằng phương pháp điện di 2 chiều. 3. Mô phỏng các phương pháp lai. BÀI 1: CHIẾT TÁCH ADN TỪ TẾ BÀO LÁ NON 1. Vật liệu và hóa chất 1.1 Vật liệu sinh học Lá non 1.2 Hóa chất Dung dịch đệm 1.5 CTAB (Cetyltrimethyllammonium bromide) 1.5% CTAB 75mM Tris-HCL 15mM EDTA 1.05M NaCl Đệm kết tủa CTAB 1% CTAB 50mM Tris-HCL 10mM EDTA Đệm TE 10mM Tris-HCl 1mM EDTA Đá khô Nitơ lỏng Chloroform: isoamylalcohol (24:1) 10mg/ml RNase 99.5% , 70% ethanol 1M NaCl 10% CTAB 1Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 2. Dụng cụ thiết bị Máy xay Máy li tâm Eppendorf 1.5ml Ống dùng để quay li tâm loại 50 ml Micropipette 20, 200, 1000µl Bình tam giác 3. Nguyên tắc Để tiến hành tách ADN từ tế bào thì ta phải tiến hành phá bỏ màng tế bào và màng nhân, sau đó biến tính protein để loại bỏ lượng protein chứa trong dịch tách, loại bỏ RNA và sau cùng là kết tủa ADN bằng cồn. Tủa sau khi thu được được hòa tan lại trong dung dịch đệm TE hoặc nước cất vô trùng tùy theo mục đích nghiên cứu. Khác với tách mô động vật, khi tách mô thực vật thì ta phải tiến hành loại bỏ đường thành phần có nhiều trong mô thực vật. Ở đây ta dùng phương pháp tách CTAB tức là dùng dung dịch đệm CTAB để tách ADN ra khỏi mô thực vật. Chất này chỉ hòa tan ADN chứ không hòa tan được đường, nhờ vậy mà có thể loại bỏ đường ra khỏi dịch chiết tách ADN. 3.1 Phá bỏ màng tế bào và màng nhân Người ta có thể phá bỏ màng tế bào và màng nhân bằng phương pháp hóa học hay cơ học. Ở đây chúng ta dùng phương pháp cơ học, nghiền nát bằng máy xay và dùng nitơ lỏng để phá bỏ tế bào lá lúa. 3.2 Chiết ADN và loại bỏ protein Sau khi phá bỏ màng tế bào và nhân thì dùng dung dịch đệm CTAB để hòa tan ADN. Nhưng trong dịch chiết có lẫn protein và ARN nên để thu nhận được ADN tinh sạch ta phải tiến hành bước loại bỏ protein và ARN. Ở đây thường dùng phenol, chloroform và isoamylalcohol. Phenol có tác dụng làm biến tính protein và không hòa tan nucleic acid. Chloroform cũng có tác dụng làm biến tính protein nhưng nó còn có tác dụng loại bỏ hoàn toàn phenol ra khỏi phần dung dịch có chứa ADN. Isoamylalcohol có tác dụng ổn định giữa hai pha nước và pha chloroform. 2Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 3.3 Kết tủa CTAB và ADN Để loại bỏ CTAB thì cần phải kết tủa CTAB và ADN rồi sau đó hòa tan ADN trong dung dịch NaCl mà tủa CTAB không tan trong dung dịch này. 3.4 Loại bỏ CTAB và làm sạch ADN Sau khi loại bỏ CTAB bằng dung dịch HCl 1M, ta tiến hành kết tủa ADN bằng etanol nguyên chất lạnh, để tăng khả năng kết tủa ta có thể pha thêm dung dịch muối CH3COONa 3M (2 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần tủa, 0.1 thể tích dung dịch muối/ thể tích dung dịch cần tủa. Ngoài ra còn có thể tủa bằng isopropanol (0.8-1 thể tích Isopropanol/ thể tích dung dịch cần tủa. Muối lẫn trong ADN sẽ ảnh hường đến kết quả các thí nghiệm sau này nên người ta thường tiến hành rửa tủa ADN bằng dung dịch ethanol 70%. 4. Các bước tiến hành 4.1. Nghiền nhỏ mẫu thực vật - Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuyễn, sau đó cho 8 g lá lúa (được làm đông lạnh trước khi dùng) xay cho đến khi thành bột mịn. - Chuyển bột lá mía vào cốc đã được làm lạnh trên nitơ lỏng trước rồi cho vào cốc 50 ml nitơ lỏng. Đặt ở -20 độ trong vòng 6 tiếng. 4.2. Sử dụng dung dịch đệm CTAB để tách ADN và loại bỏ protein - Cho 20 ml dung dịch đệm đã được đun sôi vào mẫu lá lúa đã được xử lí trên rồi tiến hành lắc nhẹ. - Ngâm trong bể nước nóng ở 56 độ trong vòng 20 phút. - Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng. Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ống dùng để quay li tâm và tiến hành quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút) - Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2 ml dung dịch CTAB 10 % đã được hâm nóng ở 70 độ.Sau đó trộn đều. - Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng.Sau đó quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút). Thu lớp nước trên vào ống nghiệm mới. 3Thí nghiệm Sinh học phân tử Biên soạn : ThS. Nguyễn Thị Lan 4.3 Kết tủa CTAB và ADN - Cho 30 ml ...