Thực hành môn công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật

Begomovirus là các virus có bộ gien DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2.6 – 2.8kb. Begomovirus có thể có bộ gien đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép(gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B). Hình 1. Tổ chức bộ gien phân tửDNA-A của begomovirus. CP =coat protein. REn = replicationenhancer. TrAP = transcriptionalactivator protein. Rep = replicationassociated protein.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thực hành môn công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật THỰC HANH ̀ Môn CNSH trong BVTV ̀ ́ ̣ Bai 1. PCR phat hiên begomovirus1. Giới thiêu ̣Begomovirus là các virus có bộ gien DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2.6 – 2.8kb. Begomovirus có thể có bộ gien đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép(gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B) AV2 AC4 Hình 1. Tổ chức bộ gien phân tử DNA-A của begomovirus. CP = coat protein. REn = replication DNA-A enhancer. TrAP = transcriptional ~2.7kb AV1 (CP) activator protein. Rep = replication AC1 (Rep) associated protein. (Rep) AC3 (REn) AC2 (TrAP) ̀2. Môi PCR Sử dung môt căp môi chung (degenerate primers) được thiêt kế ơ vung bao thủ cua ̣ ̣ ̣ ̀ ́ ̀ ̉ ̉phân tử DNA-A để phat hiên virus ́ ̣ Kích thước Mồi Trình tự (5’ – 3’) Vị trí (bp) Tham khảoBegoAFor1 TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* ~1200 Hình 2BegoARev1 ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC** Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T), K (G / T) và i = inosine AC2 AC4 AV2 AC3 AC1 AV1 (CEGPCKVQS) (IPT/A/SIF/VLCNP) DNA-A BegoAFor1 ~ 1.2 kb BegoARev1 Hình 2. Sơ đồ tổ chức bộ gien DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của begomovirus và vị trí tương đối của cặp mồi BegoAFor1 và BegoARev1. Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các ORF. Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với 2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1. 13. Chiêt DNA tông số từ mô cây. ́ ̉Chuẩn bị: 1. Đêm chiêt (đệm CTAB) ̣ ́ 2. Chloroform: Isoamylalcolhol (24:1) 3. β Mercaptoethanol (BME) 4. Ethanol 70% 5. 2-Propanol 6. Chày, cối sứ (hoăc tube 1.5 mL và chay nhựa): rửa sạch ngâm trong dung dịch ̣ ̀ NaOH 3M (1 ngày), rửa lại bằng nước cất rồi hấp vô trùng. 7. Tube 1,5ml ́ ́ ́ 8. But viêt kinh 9. Pipet (1000, 200) và tip 10. May li tâm để ban (15000 g) ́ ̀ 11. Bể nhiêt ̣Quy trình chiết 1. Ủ đệm chiết CTAB (cứ 1 mẫu chiết cần 1ml đệm) đã bổ sung BME (với tỉ lệ 1ml đệm CTAB :10 μL BME) trong bể nhiệt ơ nhiệt độ 60oC trong 30 phút. 2. Lấy 0,1 g mô lá bệnh nghiền với 1ml CTAB bằng chày cối sứ (nghiền đến khi dung dịch thu được là một thể đồng nhất). Hút 700 mL dịch chiết cho vào tube 1,5 ml. 3. Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch trên tủa (600 μL) cho vao tube ̀ mới 4. Cho Chloroform: Isoamylalcolhol (24 :1) vào tube với tỉ lệ thể tích tương đương. Đảo đều tube. 5. Li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trên tủa (400 μL). 6. Lặp lại các bước 3, 4, 5 thêm một lần nữa. 7. Cho thể tich tương đương (400 μL) 2-propanol vao tube. Đảo đều tube và để ́ ̀ ̣ ́ lanh (-20 oC) 30 phut. 8. Li tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ dịch phía trên, thu lấy cặn DNA ̉ tông sô. ́ 9. Rửa cặn bằng Ethanol 70% hai lần (môi lân 0.7 – 1 mL) ̃ ̀ 10. Làm khô căn DNA bằng cách mơ nắp tube, để ơ nhiệt độ phòng trong 30 phút ̣ (nơi sach). ̣ 11. Hoa căn trong 50 μL nước cất 2 lân vô trùng hoăc đêm TE và bao quan dich ̀ ̣ ̀ ̣ ̣ ̉ ̉ DNA ơ -20 oC4. Thực hiên phan ứng PCR ̣ ̉Chuân bị ̉1. Tube PCR 0,5 ml hấp khử trùng.2. Đá lanh vun (nêu không có hôp lanh chuyên dung) ̣ ̣ ́ ̣ ̣ ̣ ́3. May PCR 24. Pipet (200, 20, 10, 2.5) và tip tương ứng ́Thao tac ̀ ̃ ́ ̀ ̀Cho vao môi tube PCR cac thanh phân sau: Thành phần Thể tích cần lấy (μL) Dd H2O 19.3 ̣ Đêm PCR (10X) ...