Thực nghiệm PCR

PCR machine PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1 kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base). DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọi là cặp base. Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thực nghiệm PCR Thực nghiệm PCRFigure 1: PCR machinePCR được dùng để khuếch đại mộtđoạn DNA ngắn, đã xác định đượcmột phần. Đó có thể là một genđơn, hay một phần của gen. Tráivới sinh vật sống, quy trình PCR cóthể copy một mảnh DNA ngắn, cóthể lên đến 10kb (kb = 1kilobasepair = kilo cặp base = 1000cặp base). DNA là một sợi đôi, vàvì vậy nó được đo với DNA bổsung … gọi là cặp base. Một vàiphương pháp có thể copy mộtmảnh kích thuớc lên đến 40kb íthơn nhiều so với nhiễm sắc thểDNA trong tế bào eukaryote – vídụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉcặp base.Như đã thực hành hiện nay, PCRcần rất nhiều thành phần. Nhữngthành phần đó là: - DNA mẫu(template) chứa mảnh DNA cầnkhuếch đại - Cặp mồi(primer), đểxác định điểm bắt đầu và kết thúcvùng cần khuếch đại (xem phầntiếp theo về mồi) - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việcnhân lên của DNA. - Nucleotides(ví dụ dNTP)là nguyên liệu choDNA-polymerase để xây dựngDNA mới. - Dung dịch đệm, cungcấp môi trường hóa học cho DNA-polymerasePhản ứng PCR được thực hiệntrong chu kỳ nhiệt. Đây là máy đunnóng và làm nguội trong ống phảnứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗiphản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơicủa hỗn hợp phản ứng, phần nắpđậy của máy PCR cũng được đunnóng, trường hợp lượng dung dịchphản ứng quá ít, người ta cho mộtlớp dầu (natural oil) lên trên bề mặthỗn hợp phản ứng. Năm 2004, giámáy khoảng 2500 USD.Đoạn mồiĐoạn DNA cần khuếch đại đượcxác định bằng mồi chọn lọc. Mồi lànhững đoạn ngắn, sợi DNA nhântạo – không quá 50 (thường 18-25)nucleotides (vì DNA thường là sợiđôi, chiều dài của nó được xác địnhbằng số lượng cặp base (bp); chiềudài của sợi đơn DNA được đo bằngbase hay nucleotides) phù hợp mộtcách chính xác ở điểm bắt đầu vàkết thúc của DNA cần khuếch đại.Nó gắn chặt với DNA mẫu ở nhữngđiểm khởi đầu và kết thúc, nơi màDNA-polymerase nối và bắt đầuquá trình tổng hợp của sợi DNAmới.Sự lựa chọn về chiều dài của nhữngđoạn mồi và nhiệt độ biến tính củanó (Tm-melting) phụ thuộc vào số… Nhiệt độ biến tính của mồi –đừng nhầm lẫn với nhiệt độ biếntính của DNA trong chu kỳ đầu tiêncủa quá trình PCR -- được địnhnghĩa là nhiệt độ dưới lúc mồi bámvào DNA mẫu và nhiệt độ trên lúcmồi tách ra khỏi DNA mẫu. Nhiệtđộ biến tính tỉ lệ thuận với chiềudài đoạn mồi. Mồi quá ngắn sẽ bámnhiều vị trí trên DNA mẫu dài và sẽcho kết quả không rõ ràng. Mặtkhác chiều dài DNA bị giới hạn bởinhiệt độ cần biến tính. Nhiệt độbiến tính quá cao, ví dụ như trên80°C sẽ gây ra nhiều vấn đề vìDNA-polymerase hoạt động kém ởnhiệt độ đó. Chiều dài tốt nhất củađoạn mồi là từ 20-40 nucleotide vớinhiệt độ biến tính khoảng từ 60 –75°C.Thỉnh thoảng những đoạn mồi đãthoái hóa cũng được sử dụng.Những đoạn mồi này là hỗn hợptương tự nhưng không giống hoàntoàn. Nó có thể thuận tiện nếu cócùng gen cần khuếch đại từ nhữngsinh vật khác nhau, như bộ gen củanó có thể là tương tự nhưng khônggiống nhau. Người ta còn dùngnhững đoạn mồi đã thoái hóa khimồi được thiết kế dựa trên chuỗiprotein. Như nhiều codon có thể mãhóa cho nhiều acid amin, thườngrất khó để suy ra codon nào dùngcho trường hợp đặc biệt. Vì vậyđoạn mồi tương ứng với axit aminisoleucine có thể là “ATH”, A cónghĩa là adenine, T là thymine, vàH ứng với adenine, thymine, haycytosine. (Xem mã di truyền đểhiểu them về codons) Sử dụng đoạnmồi đã thoái hóa có thể làm giảmđặc trưng của phản ứng khuếch đạiPCR. Vấn đề có thể được giảiquyết bằng phương pháptouchdown PCR.Vấn đề thiết kế mồi chính xác đãđược đề cập ở trên cần phụ thuộcvào sản xuất sản lượng: - hàmlượng GC nên trong khoảng 40-60% - Tính toán nhiệt biến tính chocả những đoạn mồi trong phản ứngkhông khác quá 50°C và nhiệt biếntính của sản phẩm khuếch đạikhông khác mồi quá 10°C - Nhiệtđộ bám vào thỉnh thoảng thấp hơnnhiệt nóng chảy 50°C. Tuy nhiên,nên chọn lựa theo kinh nghiệm chotừng trường hợp cụ thể. - Tránh …- Kết thúc đầu 3’ rất nhạy cảm – nócó thể không bổ sung cho bất cứvùng nào của đoạn mồi trong phảnứng và phải cung cấp base chínhxác phù hợp với mẫu. Có cảchương trình hỗ trợ việc thiết kếmồi (xem External links)Quy trìnhQuy trình PCR gồm 20 đến 30 chukỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình2)(1)Nhiệt độ tăng lên 94-96°C đểtách hai sợi DNA ra. Bước này gọilà biến tính, nó phá vỡ cầu nốihydrogen nối 2 sợi DNA. Trướcchu kỳ 1, DNA thường được biếntính đến thời gian mở chuỗi để đảmbảo mẫu DNA và mồi được phântách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợiđơn. Thời gian: 1-2 phút(2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệtđộ được hạ thấp xuống để mồi cóthể gắn vào sợi DNA đơn. Bướcnày gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giaiđoạn này phụ thuộc vào đoạn mồivà thường thấp hơn nhiệt độ biếntính 50°C (45-60°C). Sử dụng sainhiệt độ trong giai đoạn này dẫnđến việc đoạn mồi không gắn hoàntoàn vào DNA mẫu, hay gắn mộtcách tùy tiện. Thời gian: 1-2 phút.(3) Cuối cùng, DNA polymerasegắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầubám vào và hoạt động dọc theo sợiDNA. Bước này gọi là kéo ...