TIỂU LUẬN: CÁC KỸ THUẬT ELISA

Trong các nghiên cứu thí nghiệm, thực nghiệm cũng như thực tế phát hiện và điều trị các bệnh lý trên người, động vật và thực vật, lĩnh vực chẩn đoán luôn đóng một vai trò thiết yếu. Trong số những kỹ thuật quan trọng trong chẩn đoán, không thể không kể đến ELISA. ELISA là kỹ thuật được sử dụng rất rộng rãi trong y dược, thú y và bệnh lý thực vật, và cho đến nay vẫn là một trong những phương pháp chẩn đoán quan trọng nhất trong miễn dịch học cũng như một số lĩnh vực...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
TIỂU LUẬN: CÁC KỸ THUẬT ELISA TIỂU LUẬN CÁC KỸ THUẬT ELISA 1 1. Đặt vấn đề: Trong các nghiên cứu thí nghiệm, thực nghiệm cũng như thực tế phát hiện và điều trị các bệnh lý trên người, động vật và thực vật, lĩnh vực chẩn đoán luôn đóng một vai trò thiết yếu. Trong số những kỹ thuật quan trọng trong chẩn đoán, không thể không kể đến ELISA. ELISA là kỹ thuật được sử dụng rất rộng rãi trong y dược, thú y và bệnh lý thực vật, và cho đến nay vẫn là một trong những phương pháp chẩn đoán quan trọng nhất trong miễn dịch học cũng như một số lĩnh vực khác. Qua quá trình phát triển, nghiên cứu và ứng dụng thực nghiệm, ELISA đã có nhiều cải tiến và biến đổi, phân thành nhiều kỹ thuật nhỏ nhằm phù hợp cho từng trường hợp, từng điều kiện, từng đối tượng cụ thể. Sự đa dạng của ELISA dẫn đến sự cần thiết phải có một cái nhìn tổng thể, bao quát và so sánh cụ thể từng biến thể của ELISA nhằm lựa chọn và sử dụng các kỹ thuật trên một cách phù hợp nhất cho từng hoàn cảnh. Đó chính là mục đích của bài viết này. 2. Tổng quan: Enzyme-linked immunosorbent assay, hay còn gọi là ELISA, enzyme immunoassay hay EIA là kỹ thuật chẩn đoán dựa trên miễn dịch học rất phổ biến trong rất nhiều lĩnh vực, từ y học, y dược, thú y, sinh học, kiểm định thực phẩm, môi trường v.v… ELISA phổ biến rộng rãi nhờ vào những đặc tính có lợi cho thực nghiệm của nó: dễ thực hiện, tốc độ nhanh, chi phí thấp, dễ sản xuất, an toàn với độ nhạy và độ đặc hiệu chấp nhận được. Tiền thân của ELISA là kỹ thuật miễn dịch học phóng xạ (radioimmunoassay – RIA), được phát triển bởi Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Aaron Berson (xuất bản lần đầu tiên năm 1960; Nobel y học cho Rosalyn S. Yalow năm 1977). Mặc dù phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, tuy nhiên việc đánh đấu bằng phóng xạ yêu cầu kỹ thuật cao, phức tạp, tốn kém, cũng như việc sử dụng phải vô cùng cẩn thận vì khả năng gây nguy hiểm của phóng xạ đã đưa đến nhu cầu tìm kiếm các phương pháp cải tiến thay thế. Để thay cho việc sử dụng chất đánh dấu phóng xạ, người ta đã sử dụng kỹ thuật liên kết kháng nguyên hoặc kháng thể với một enzyme (enzyme-linked) có khả năng thực hiện một phản ứng nhận biết (ví dụ như gây đổi màu một chất). Quy trình liên kết enzyme được phát triển độc lập bởi Stratis Avrameas và G.B. Pierce. Bên cạnh đó, việc cần phải loại bỏ các kháng nguyên/kháng thể thứ cấp không gắn dẫn tới kỹ thuật cố định các kháng nguyên/kháng thể sơ cấp (immunosorbent) được công bố bởi Wide và Jerker Porath năm 1966. Năm 1971, hai nhóm nghiên cứu Peter Perlmann và Eva Engvall cùng với Anton Schuurs và Bauke van Weemen đã độc lập công bố các bài báo tổng hợp các kỹ thuật trên thành ELISA. 3. ELISA – nguyên lý cơ bản và các biến thể: 3.1. Nguyên lý cơ bản: Theo nguyên lý cơ bản của miễn dịch học, mỗi một kháng nguyên (antigen) có nhiều yếu tố kháng nguyên (epitope), mỗi một epitope có khả năng kết hợp với một kháng thể (antibody) tương ứng với nó. Hầu hết các kháng nguyên đều có một hoặc vài epitope đặc trưng cho nó, dựa trên đó mà người ta có thể xác định được kháng nguyên. Bên cạnh đó, sự xuất hiện của kháng nguyên trong cơ thể trong một số trường hợp có khả năng kích thích cơ thể tạo ra kháng thể đơn dòng đặc hiệu để chống lại kháng nguyên đó. Thông qua việc xác định kháng thể này người ta cũng có thể gián tiếp xác định kháng nguyên trong cơ thể. 2 Dựa trên cơ sở đó, kỹ thuật ELISA được thiết lập nhằm chẩn đoán sự hiện diện của một kháng nguyên hay kháng thể. Để xác định một yếu tố cần chẩn đoán (kháng nguyên/kháng thể) người ta sử dụng một hoặc nhiều yếu tố phát hiện (kháng thể/kháng nguyên/bổ thể) có phản ứng miễn dịch đặc hiệu với yếu tố cần chẩn đoán. Các yếu tố phát hiện này được đánh dấu bằng enzyme sao cho phản ứng miễn dịch với yếu tố cần chẩn đoán sẽ tạo nên sự thay đổi có thể nhận biết được bằng mắt thường hay thậm chí định lượng được bằng các công cụ so màu khác khi cho cơ chất của enzyme đánh dấu vào. 3.2. Các biến thể của ELISA: Mặc dù nguyên tắc của ELISA khá đơn giản, nhưng qua quá trình thực nghiệm sử dụng đã vấp phải khá nhiều vấn đề, từ các vấn đề về hiệu quả của phương pháp như độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện cho đến những vấn đề về thực nghiệm như thời gian thực hiện, độ phức tạp, chi phí cũng như khả năng hệ thống hóa thành bộ dụng cụ (KIT) để sản xuất công nghiệp. Chính vì vậy, người ta đã không ngừng cải tiến phương pháp này, đưa ra nhiều phương pháp mới phù hợp với từng điều kiện, từng đối tượng khác nhau. Cho đến nay, đã có rất nhiều biến thể đa dạng của ELISA. Tuy nhiên nhìn chung, tất cả các biến thể này có thể được phân loại như sau: • ELISA dị pha (heterogeneous), hay còn gọi là ELISA pha rắn (solid phase), gồm các phương pháp: - ELISA trực tiếp (direct ELISA) - ELISA gián tiếp (indirect ELISA) - ELISA sandwich - ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) • ELISA đồng pha (homogeneous), gồm các phương pháp ELISA đồng pha cạnh tranh (competitive) và không cạnh tranh (non-competitive). Trong giới hạn bài viết này, chỉ có thể khái quát về phương pháp chung cho từng loại biến thể trên. Trong thực nghiệm chẩn đoán, cần có những điều chỉnh thích hợp đối với từng quy trình cụ thể cho từng đối tượng khác nhau. Các ký hiệu quy ước trong các phần sau: ] Bề mặt rắn Ag Kháng nguyên mẫu. Ở đây quy ước là những yếu tố cần xác định trong mẫu có mang các yếu tố kháng nguyên (epitope) và có thể là một loại kháng thể. Agc Kháng nguyên cạnh tranh Ab Kháng thể E Enzyme AAb Kháng kháng thể . Liên kết giữa chất cần đánh dấu và chất đánh dấu = Liên kết với bề mặt rắn – Liên kết miễn dịch 3.2.1. ELISA dị pha: Trong ELISA dị pha, các ...