Tinh sạch protein (p-1)

Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tinh sạch protein (p-1) Tinh sạch protein (p-1)Sự tinh sạch của protein rấtquan trọng vì từ protein tinhsạch chúng ta có thể xác địnhđược trình tự acid amin, mốiliên hệ về tiến hóa giữa cácprotein trong những cá thể khácnhau và khảo sát các chức năngsinh hóa của các protein đó.Hơn thế nữa, việc tinh thể hóaprotein chỉ có thể thực hiện vớinhững protein tinh sạch và từnhững tinh thể đó chúng ta sẽbiết được cấu trúc bậc 4 cũngnhư các đơn vị chức năng củaprotein thông qua dữ liệu chiếuxạ tia X.I. Giới thiệu chungVì vậy, quá trình tinh sạch proteinkhông ngừng được cải tiến để đạtđược độ tinh sạch cao nhất nhưngnhìn chung một quá trình tinhsạch protein cũng cần đi qua cácbước căn bản sau:1. Nhận biết protein mục tiêu2. Ly trích protein từ tế bào3. Thu nhận protein mục tiêu dựatrên độ hoà tan, kích thước, điệntích, và liên kết ái lực4. Phân tách protein bằng điện ditrên gel5. Xác định trọng lượng và khốilượng của proteinII. Nhận biết protein mục tiêuKết quả của sự tinh sạch là mộtmẫu protein chỉ chứa đúng mộtloại phân tử, ở đây là một loạiprotein mà nhà sinh hóa quantâm. Mẫu protein này chỉ là mộtphân đoạn chiếm 1% vật liệu banđầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tếbào hay một cơ quan riêng biệtlấy của thực vật hay động vật. Đểxác định được protein mục tiêu từhỗn hợp protein, nhà sinh hóa cầnthực hiện một thử nghiệm dựa vàođặc tính của protein đó. Nếuprotein mục tiêu là một enzymethì thử nghiệm sẽ được thực hiệndựa trên hoạt tính của enzyme đó.Cụ thể như với enzyme lactatedehydrogenase, một enzyme cóvai trò trong việc sản xuất nănglượng từ glucose cũng như tổnghợp glucose từ lactate, để xácđịnh enzyme này thì dựa trênphản ứng của nó trong tế bào. Sauđó, dựa vào khả năng hấp thụ ánhsáng mạnh ở bước sóng 340nmcủa Nicotinamide adeninedinucleotide (NADH), ta có thểđo được lượng ánh sáng được hấpthụ ở bước sóng 340nm trong mộtđơn vị thời gian để xác định hoạttính của enzyme lactatedehydrogenase. Trên thực tế việctìm ra một thử nghiệm hiệu quảthường rất khó, nhưng nếu cóđược một cách thử nghiệm càngđặc hiệu thì quá trình tinh sạchcàng hiệu quả. Tuy nhiên, để chắcchắn quá trình tinh sạch hoạt độngtốt, chúng ta còn cần một thông sốlà lượng protein có trong hỗn hợpđược thử nghiệm.Hiện nay có rất nhiều phươngpháp phát hiện nhanh và chínhxác nồng độ protein. Dựa vào 2thông số thực nghiệm là hoạt tínhenzyme và nồng độ protein, ta cóthể xác định hoạt tính riêng củaenzyme tức là tỉ lệ hoạt tínhenzyme với hàm lượng protein cótrong mẫu thử nghiệm. Hoạt tínhriêng càng cao thì quá trình tinhsạch càng hiệu quả hay nói cáchkhác, mục tiêu của việc tinh sạchlà làm tăng tối đa hoạt tính riêng.III. Ly trích protein từ tế bàoKhi đã tìm ra thử nghiệm phù hợpvà chọn được nguồn protein,chúng ta cần phân đoạn dịch tếbào thành nhiều phần và xác địnhxem phần nào chứa nhiều proteinmục tiêu. Quá trình tìm phân đoạnmục tiêu được phát triển bằng sựmày mò qua từng thí nghiệm.Bước đầu tiên là phá vỡ màng tếbào, tạo thành hỗn hợp đồng chất.Sau đó phân đoạn hỗn hợp bằngly tâm, dịch nổi chứa phân tử cótrọng lượng thấp, những phân tửcó trọng lượng cao hơn lắngxuống đáy ống ly tâm. Dịch nổilại được ly tâm lần nữa với lựcmạnh hơn để tạo cặn và dịch nổimới. Tiến trình này, được gọi là lytâm phân đoạn, sẽ tạo được nhiềuphân đoạn khác nhau với tỉ trọnggiảm dần, mỗi phân đoạn nàychứa hàng trăm phân tử proteinkhác nhau, sẽ được tinh sạch saukhi đã qua thử nghiệm hoạt tính.Thông thường, một phân đoạn cóhoạt tính cao sẽ là nguồn vật liệucho các kỹ thuật tinh sạch hiệuquả.lựcHình 1: minh họa sắc ký trao đổiionHình 2: minh họa cơ chế giữaprotein trong hệ sắc ký trao đổiion(a) Những hạt mang điện tíchdương sẽ trao đổi ion âm với dungdịch đệm. Protein tích điện âmcũng ion dương tương tác với nó(b) Khi protein gắn với hạt,protein thay thế những ion âmtương tác với hạt cũng như hạtthay thế những ion dương tươngtác với protein.Xác định khối lượng củaproteinPhép ghi phổ khối lượng là mộtkỹ thuật dùng để phân tích tronghóa học hữu cơ trong nhiều năm.Tuy nhiên, cho đến gần đây, khảnăng bay hơi quá thấp của proteinđã làm mất tác dụng của phép ghiphổ khối lượng trong việc nghiêncứu các phân tử này. Khó khănnày đã được khắc phục khi cónhững kỹ thuật chuyển protein vànhững đại phân tử khác thànhdạng khí được đưa vào ứng dụnglà matrix-assisted laserdesorption-ionization (MALDI)và electrospray spectrometry. Ởđây tập trung vào kỹ thuậtMALDI. Trong kỹ thuật này,những ion protein được phóng ravà sau đó được tăng tốc qua mộtđiện trường. Những ion này sẽ dichuyển qua một đường ống dàiđược hút chân không (flight tube),ion nhỏ nhất sẽ di chuyển nhanhnhất và đến đầu đọc trước nhất.Vì vậy, dựa vào thời gian bay(time of flight - TOF) trong điệntrường ta có thể biết khối lượngcủa protein (hay chính xác hơn làtỉ lệ giữa khối lượng với điệntích). Với một lượng nhỏ phân t ...