Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán viêm gan virus C

Trong những thập kỷ cuối của thế kỷ 20, sự ra đời của sinh học phân tử đã đem lại những đột phá về mặt công nghệ, tạo ra các phương tiện có giá trị cao để sử dụng trong chẩn đoán các bệnh về vi sinh vật nói chung cũng như các bệnh lý về viêm gan virus nói riêng, nhờ đó mà có rất nhiều bệnh được điều trị triệt để.Ngày nay, việc ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán điều trị bệnh viêm gan do virus nói chung và bệnh do viêm gan virus...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán viêm gan virus C Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán viêm gan virus CTrong những thập kỷ cuối của thế kỷ 20, sự ra đời của sinh học phân tử đ ã đem lạinhững đột phá về mặt công nghệ, tạo ra các phương tiện có giá trị cao để sử dụngtrong chẩn đoán các bệnh về vi sinh vật nói chung cũng như các bệnh lý về viêmgan virus nói riêng, nhờ đó mà có rất nhiều bệnh được điều trị triệt để.Ngày nay, việc ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán điều trị bệnh viêm gando virus nói chung và bệnh do viêm gan virus C ngày càng trở lên quan trọng,chúng trở thành các chỉ định xét nghiêm bặt buộc trong điều trị viêm gan virus Cnhất là viêm gan C kháng thuốc, chúng đặc biệt hữu ích trong việc thiết lập điềutrị, thay đổi điều trị, đánh giá về virus học cũng nh ư sự kháng thuốc của virusviêm gan C. Hiện tại, có một số kỹ thuật sinh học phân tử sau được ứng dụngtrong chẩn đoán và điều trị viêm gan virus C.1. Các kỹ thuật khuếch đại mục tiêu.Nguyên tắc cơ bản của các kỹ thuật khuếch đại mục tiêu là tổng hợp một số lượnglớn bản sao của các bộ gen virus (được gọi là các sản phẩm khuếch đại PCR, LCR,amplicon) trong một phản ứng men theo chu kỳPhản ứng chuỗi polymerase (PCR) phát hiện HCV RNA: phương pháp này dùngnhiều nhiệt độ khác nhau và chung một enzym polymerase chịu nhiệt. Các sảnphẩm khuếch đại là các DNA mạch đôi. PCR được áp dụng cho các virus DNAtrực tiếp, tuy nhiên với virus RNA (như HCV) một bước sao chép ngược là cầnthiết, để tổng hợp DNA bổ trợ dùng làm khuôn trong phản ứng PCR.Khi mỗi chu kỳ PCR hoàn tất, số lượng bản sao được nhân đôi, sau n chu kỳ 2nbản sao của mỗi phân tử ban đầu được tổng hợp về mặt lý thuyết. Việc phát hiệncác sản phẩm khuếch đại dựa vào phương pháp lai đặc hiệu.Việc định lượng đượcdựa vào khuếch đại cạnh tranh của khuôn virus với một lượng chuẩn tổng hợpthêm vào mỗi ống phản ứng.PCR thời gian thực phát hiện HCV RNA: nguyên tắc kỹ thuật này là nhằm pháthiện sự tổng hợp sản phẩm khuếch đại và suy ra số lượng bộ gen virus trong mẫulâm sàng từ lúc khởi đầu chứ không chờ đến cuối phản ứng. Kỹ thuật này nhạyhơn PCR cổ điển, kỹ thuật này có thể được tự động một phần hoặc tự động hoàntoàn.Khuếch đại qua trung gian phiên mã (TMA) phát hiện HCV: đây là cách khuếchđại acid nucleic thế hệ mới, thuộc hệ khuếch đại phiên mã RNA bằng cách dùng 2enzym thực hiện phản ứng: T7 RNA polymerase và men phiên mã ngược. TMA làphương pháp đẳng nhiệt, toàn bộ phản ứng thực hiện cùng một nhiệt độ.Sau khi phân giải vỏ ngoài và capsid của virus, bộ gen virus bị bắt giữ bởi bộ dòoligoglicosid và gắn kết vào các vi hạt từ (magnetic microparticles). Khuếch đạibao gồm sự sản xuất đẳng nhiệt tự xúc tác của phiên mã RNA với 2 enzym. MỗiRNA được tổng hợp mới vào lại quá trình TMA và dùng như một khuôn cho mộtvòng sao chép mới gây khuếch đại RNA mục tiêu theo hàm số mũ.2. Các kỹ thuật khuếch đại tín hiệu.Trong các kỹ thuật khuếch đại tín hiệu, bộ gien virus lúc đầu được lai vào một giábằng các bộ dò oligonucleotid bắt giữ đặc hiệu, sau đó tín hiệu phát ra bởi các laiđược khuếch đại và đo lường. Có hai kỹ thuật hay sử dụng:Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture)Kỹ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology)3. Phân tích trình tự bộ gen HCV.Phân tích trình tự bộ gen virus nhằm vào việc xác định các trình tự ký tên ( điềunày được dùng để phân loại các chủng virus theo lợi ích lâm sàng, gọi là kiểu gencủa virus ) hoặc các thay thế acid amin ở các vị trí đặc biệt ( điều n ày được dùngđể xác định các acid amin đã biết liên quan đến sự kháng thuốc ). Phân tích trìnhtự bộ gen dựa vào việc xác định trình tự trực tiếp, cung cấp toàn bộ trình tự củađoạn được phân tích, hoặc các kỹ thuật thay thế nhận dạng các tr ình tự đặc hiệu ởcác vị trí cho sẵn.Có hai kỹ thuật thường áp dụng:Xác định trình tự trực tiếp của các sản phẩm khuếch đại HCV PCR: được thựchiện sau phản ứng xác định trình tự trong một thiết bị xác định trình tự DNA tựđộng. Thiết bị có thể dùng để xác định trình tự nucleotid chính xác và trịnh tự acidamin suy ra của đoạn được phân tích. Điều này được áp dụng vào việc phát hiệncác loại hình đột biến.Lai ngược của các sản phẩm khuếch đại HCV PCR: việc xác định trình tự trựctiếp tốn nhiều công sức và chỉ thực hiện ở viện nghiên cứu đặc biệt, do đó cho đếnnay có nhiều kỹ thuật mới được phát triển để áp dụng cho lâm sàng, trong đó đượcứng dụng nhiều nhất là phương pháp dựa vào lai ngược các sản phẩm khuếch đạiPCR.Trong các xét nghiệm này, khuếch đại PCR của vùng được quan tâm theo phươngpháp lai với các bộ dò oligonucleotid cố định vào một pha rắn. Các bộ dò nàyđược thiết kế bổ trợ cho nhiều trình tự khác nhau.Tóm lại, với sự ra đời và cải tiến không ngừng của kỹ thuật sinh học phân tử, cácxét nghiệm này được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán, giúp tiên lượng cũng nhưquyết đ ...