Vai trò của đột biến kép ở hai vị trí D260E và Y230V trong Enzim Êpoxit Hydrolaza của hạt đậu tương

Bài viết trình bày các hydrolase epoxide (EH) được phân phối rộng rãi trong nhiều cơ thể, bao gồm cả vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật. Những enzyme này là một nhóm thú vị của các enzyme liên quan đến chức năng xúc tác thêm phân tử nước vào epoxit (oxirane moiety), tạo ra 1-2 diol tương ứng. Gần đây các nghiên cứu đã được cung cấp thông tin có giá trị về cấu trúc phân tử của các enzyme này, cũng như cái nhìn sâu sắc về các cơ chế enzyme có liên quan.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Vai trò của đột biến kép ở hai vị trí D260E và Y230V trong Enzim Êpoxit Hydrolaza của hạt đậu tương28(2): 63-67 T¹p chÝ Sinh häc 6-2006 Vai trß cña ®ét biÕn kÐp ë hai vÞ trÝ D260E vµ Y230V trong enzim ªpoxit hydrolaza cña h¹t ®Ëu t−¬ng Nghiªm Ngäc Minh ViÖn C«ng nghÖ sinh häc £poxit hydrolaza (EH) lµ mét enzim ph©n phßng thÝ nghiÖm cña GS.TS. Fukazawa, ViÖnbè réng r·i ë nhiÒu ®èi t−îng nh− ng−êi [1, 12], nghiªn cøu thùc phÈm quèc gia NhËt B¶n.®éng vËt [2, 7], c«n trïng [5] vµ vi sinh vËt [8, Takara Ex taqTM Kit cña h·ng Takara Shuzo co.,9]. Enzim nµy cã chøc n¨ng xóc t¸c ®Ó thñy LTD. NhËt B¶n: dïng trong ph¶n øng PCR, Kitph©n vßng ªpoxy thµnh mét s¶n phÈm cã 2 TA Cloning(R) cã vect¬ pCR2.1, T4 DNA ligaza,nhãm hydroxyl (diols) n»m gÇn nhau, khi thªm tÕ bµo kh¶ biÕn cña chñng E.coli INV F cñamét ph©n tö n−íc (H2O). N¨m 1995, Katsube vµ h·ng InvitrogienTM dïng ®Ó nh©n dßng cho ®äccs. ®· c«ng bè tr×nh tù cña cDNA m· hãa cho tr×nh tù. Kit ®äc tr×nh tù: Thermo Sequenaseenzim EH [3]. Sau ®ã, Michael vµ cs. ®· chØ ra fluorescent labelled primer cycle sequencing kitr»ng bé ba Asp333 (axÝt aspactic ë vÞ trÝ 333), with 7-deaza-dGTP (RPN2438/RPN2538) cñaAsp495 vµ His523 trong EH ë chuét [7], hoÆc h·ng Amersham pharmacia biotech. C¸c enzimAsp107, Asp246 (t−¬ng ®−¬ng víi vÞ trÝ Asp260 ë giíi h¹n Nde I, EcoR I, tÕ bµo kh¶ biÕn cñah¹t ®Ëu t−¬ng) vµ His275 trong EH ë vi khuÈn [8] chñng JM109 nhËn cña h·ng Wako/Nipon®· t¹o thµnh bé ba xóc t¸c cña enzim EH d¹ng Giene vµ chñng BL21 (DE23) cña h·nghßa tan. ë ng−êi, vÞ trÝ cña Tyr385 vµ Tyr465 Novagien.(t−¬ng ®−¬ng víi vÞ trÝ Tyr125 vµ Tyr230 ë h¹t ®Ëut−¬ng) cã vai trß nhÊt ®Þnh trong t©m xóc t¸c Vect¬ biÓu hiÖn pET 21A (+) dïng ®Ó biÓu[12]. Masaomi vµ cs. (2000) còng ®· th«ng b¸o hiÖn trong E. coli nhËn tõ h·ng Invitrogien. C¸ckÕt qu¶ biÓu hiÖn vµ lµm s¹ch ®−îc enzim nµy cÆp måi ®ét biÕn ®−îc thiÕt kÕ dùa trªn tr×nh tùtrong h¹t ®Ëu t−¬ng ë d¹ng hßa tan [6]. ë h¹t cDNA (ë c¸c vÞ trÝ b¶o thñ) cña gien EH ë ®Ëu®Ëu t−¬ng, trong chuçi axÝt amin cña EH, vÞ trÝ t−¬ng cã tr×nh tù nh− sau:Asp260 (D260) vµ Tyr230 (Y230) còng cã thÓ D260E: AACAGGTGAGTTGGAGATGGT®ãng mét vai trß nhÊt ®Þnh trong viÖc duy tr× AT ACAACTC.ho¹t tÝnh enzim cña chóng. §Ó nghiªn cøu vai Y260V: ACTGGACCCTTGAACTACGTCtrß cña ®ét biÕn kÐp ë c¶ vÞ trÝ D260 vµ Y230 AGAAATTTC.trong EH cña h¹t ®Ëu t−¬ng, dùa trªn viÖc sos¸nh c¸c chuçi axÝt amin vµ sè liÖu vÒ cÊu tróc EH-Star-Sense2: ATATACATATGGAGCtinh thÓ cña enzim EH, chóng t«i ®· t¹o ®ét biÕn AAATAAAGCACAGAAC.kÐp trùc tiÕp b»ng c¸ch thay thÕ ®ång thêi Aps ë EH-End-Anti2: GTTGAATTCGTTTTTGGvÞ trÝ 260 b»ng Glu (D260E) vµ Tyr ë vÞ trÝ 230 ACAGATCAGAACTTG.b»ng Val (Y230V) nhê kü thuËt PCR. §ång thêithiÕt kÕ vµ thö kh¶ n¨ng biÓu hiÖn enzim ®ét M¸y ®äc tr×nh tù DSQ 1000 automaticbiÕn ë d¹ng hßa tan trong E. coli. DNA-SEQUENCER cña h·ng Shimadzu-NhËt B¶n. i. ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 2. Ph−¬ng ph¸p1. Nguyªn liÖu + Ph−¬ng ph¸p PCR ®· ®−îc sö dông ®Ó DNA plasmit cã mang tr×nh tù cDNA cña nh©n gien EH ®ét biÕn.gien EH b×nh th−êng ë h¹t ®Ëu t−¬ng (dïng lµm + Ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt DNA plasmit theokhu«n cho ph¶n øng nh©n b¶n-PCR), nhËn tõ Sambrook vµ cs. [10]. 63 + Ph−¬ng ph¸p nh©n dßng (®−îc tiÕn hµnh gåm toµn bé chiÒu dµi cña gien EH (cDNA) cãtheo h−íng dÉn trong TA CloningR Kit). vÞ trÝ ®ét biÕn D260E b»ng kü thuËt PCR (nhiÖt + §äc tr×nh tù cña DNA b»ng ph−¬ng ph¸p ®é ñ lµ 62oC, tiÕn hµnh trong 30 chu kú). KÕtdideoxynucleotit cña Sanger vµ cs. [11]. qu¶ ®· nhËn ®−îc 1 b¨ng DNA cã kÝch th−íc kho¶ng gÇn 1 kb kh¸ ®Æc hiÖu. §o¹n DNA nµy + Ph−¬ng ph¸p SDS-PAGE theo Laemmli ®−îc c¾t, lµm s¹ch vµ kiÓm tra trªn gel agaroza1970 [4]. 1% (h×nh 1). + Ph−¬ng ph¸p biÓu hiÖn vµ lµm s¹ch enzimEH ®ét biÕn trong E.coli: chñng E.coli BL21 bp 1 2(DE3) mang vect¬ biÓu hiÖn pRSET (cã chøagien EH ®ét biÕn) vµ pKY260 ...