Véc tơ tạo dòng simple

Kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp là công cụ tìm hiểu cấu trúc, chức năng, và sự điều hòa của các gene và sản phẩm của gene. Vector tạo dòng là 1 phân tử DNA mang DNA ngoại lai vào tế bào chủ, sao chép trong tế bào vi khuẩn hoặc nấm men để tạo ra nhiều bản sao hoặc tao ra sản phẩm protein của DNA ngoại lai...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Véc tơ tạo dòng simpleCHÖÔNG 5 Caùc vector & söï taïo doøngrDNA không phải là nhân bản động vật Kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp là công cụ tìm hiểu cấu trúc, chức năng, và sự điều hòa của các gene và sản phẩm của gene.• Các mục đích của kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp gồm: – Nhận dạng các gene – Tách các gene – Điều chỉnh các gene – Tái biểu hiện các gene ở sinh vật hoặc cơ thể chủ khác• Cho phép các nhà khoa học: – Xác định các gene mã hóa và sản phẩm của chúng (breast cancer, retino-blastoma, và neurofibromatosis) – Điều trị các bệnh do gene (cystic fibrosis, rheumatoid arthritis, vascular disease, và certain cancers ) – Sản xuất lượng lớn hormones, vaccines, và các hợp chất sinh học khác mà Y học quan tâm (Insulin, growth hormone, follicle-stimulating hormone ) Vector PlasmidVector tạo dòng là 1 phân tử DNA mang DNA ngoại lai vào tế bàochủ, sao chép trong tế bào vi khuẩn hoặc nấm men để tạo ra nhiềubản sao hoặc tao ra sản phẩm protein của DNA ngoại lai.Đặc trưng chính của các vector tạo dòng:• Có trình tự cho phép sự tự sao chép trong vi khuẩn hay nấm men• Có vị trí để chèn DNA ngoại lai. Hầu hết các vector có trình tự cắtduy nhất của nhiều enzyme cắt giới hạn (MCS)• Một phương pháp để nhận biết tế bào có chứa vector, thường làcác marker chọn lọc tính kháng kháng sinh. Các loại vector• Plasmid – DNA dạng vòng tự sao chép nhân đôi trong t ế bào vi khuẩn. Khả năng dòng hóa: 0.1-10 kilobases (kb)• Phage – dẫn xuất của bacteriophage lambda; phân tử DNA thẳng có thể được thay thế bằng DNA ngoại lai mà không làm gián đoạn vòng đời của nó. Khả năng dòng hóa: 8-20 Kb• Cosmids – DNA dạng vòng kết hợp các tính năng của plasmid và phage. Khả năng dòng hóa: 35-50 Kb• Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn (BAC) – dựa trên mini-plasmid F của vi khuẩn. Khả năng dòng hóa: 75-300 Kb• Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men (YAC) – một nhiễm sắc thể nhân tạo có chứa telomeres, nguồn gốc của sao chép (ori), centromere của nấm men, và marker để lựa chọn xác định các tế bào nấm men. Khả năng dòng hóa: 100-1000 Kb Plasmid Vectors Điện di trên gel agarose plasmid tự nhiênPlasmid nhân tạo đầu tiên pBR322 (High-Copy-Number) Plasmid tự nhiên (low copy number) pSC101Plasmid tự nhiên ColE1The pUC 18 or 19 Cloning Vector (Very high copy number) Lac Z α RE Sites in blue occur only once in the Promotor SiteOrigin ofReplication Antibiotic Resistance Multiple Gene Cloning Site MCS – Multi Cloning Site Các vị trí cắt duy nhất Chèn/cắt đoạn DNA ngoại lai dễ dàng Subcloning dễ dàng hơnChức năng sao chép không được mã hóa trênplasmid. Nó sử dụng chức năng từ cácDNA polymerase I và III, DNA-RNA polymerase củatế bào chủ.Có thể ức chế sự tổng hợp protein với thuốc khángsinh (chloramphenicol, spectinomycin). Vậy sự sao của xảychép plasmid có ra không khichloramphenicol hiện diện trong tế bào? Replicons kiểm soát khả năng tương thích của plasmid• Khả năng tương thích của plasmid: khả năng của hai plasmid khác nhau cùng tồn tại trong cùng một TB chủ• Plasmid sử dụng các hệ thống sao chép giong nhau không thể cùng tồn tại trong cùng một tế bào vi khuẩn• Các plasmid mang cùng replicon thuộc nhóm không tương thích Sự không tương thích của plasmids Khi 2 plasmid cùng chia sẽ các yếu tố cùa cùng 1 bộ máy sao chép Sẽ có sự cạnh tranh Không thể cùng tồn tại khi không có sự chọn lọc trong môi trường nuôi vi khuẩn☞ Cùng replicon  nhóm không tương thích  không thể duy trì trong cùng 1 vi khuẩnHơn 30 nhóm không tương thích được biếtPlasmid Replicon Copy NumberpBR 322 and its derivatives pMB1 15-20pUC vectors pMB1 500-700pACYC and its derivatives p15A 10-12pSC101 and its derivatives pSC101 ~5ColE1 ColE1 15-20 Sự an toàn của plasmidMột số plasmid tự nhiên có thể được chuyểngiao cho TB khác bằng conjugationConjugation đòi hỏi ba yếu tố: – Một gen linh động trans-acting (mob) – Một yếu tố cis-acting (bom) – Một vị trí cụ thể bị đứt mạch (nicked) bởi mob (nic)Một số plasmid cũ như pBR322 bị thiếu mobMột số vector mới hơn như pUC thiếu nic /bom và không thể linh độngAsilomar ConferenceNgười ta tin rằng an toàn của các chủng vi khuẩn, virút và vectơ có thể được thực hiện trong một vài tuầnNIH thành lập Ban tư vấn về DNA tái tổ hợp (RAC)Phải mất năm 1 (1976) trước khi dòng an toàn E.coliđ ầu (loại được tạo tiên EK2) đã ra.Năm đó, RAC phát hành một bộ nguyên tắ ...