Xác định kiểu gen của HPV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu gen L1

Đặt vấn đề: Hiện nay, công ty Nam Khoa đã có kit PCR-ELISA để phát hiện và định genotype HPV và kit này đã triển khai sử dụng khá hữu hiệu tại một số phòng thí nghiệm tại TP. Hồ Chí Minh. Tuy nhiên hãy còn một tiếp cận khác để có thể định được genotype HPV, đó là sử dụng phương pháp giải trình tự để giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu vùng gen L1 của HPV và so sánh trình tự này trên thư viện trình tự các genotype của HPV, nhờ vậy mà có thể cho được...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xác định kiểu gen của HPV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu gen L1 Xác định kiểu gen của HPV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản ph ẩm PCR đặc hiệu gen L1 Phạm Hùng Vân*(11), Võ Đức Xuyên An(2), Lê Thúy Quyên(1), Hòang Hiếu Ngọc(1) Tóm tắt Đặt vấn đề: Hiện nay, công ty Nam Khoa đã có kit PCR-ELISA để phát hiện và định genotype HPV và kit này đã triển khai sử dụng khá hữu hiệu tại một số phòng thí nghiệm tại TP. Hồ Chí Minh. Tuy nhiên hãy còn một tiếp cận khác để có thể định được genotype HPV, đó là sử dụng phương pháp giải trình tự để giải trình t ự tr ực ti ếp sản phẩm PCR đặc hiệu vùng gen L1 của HPV và so sánh trình t ự này trên thư viện trình t ự các genotype c ủa HPV, nhờ vậy mà có thể cho được kết quả genotype HPV. Mục tiêu đề tài: Phát triển phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu gene L1 nhờ đó xác định genotype HPV. Phương pháp nghiên cứu: Các tác giả đã thử áp dụng các tiếp cận này để định genotype 39 mẫu trích biệt DNA từ các bệnh phẩm quệt cổ tử cung xác định được genotype HPV nhờ kỹ thuật PCR-ELISA với 5 genotype 6, 8 genotype 16, 7 genotype 16, 8 genotype 58, 3 genotype 31/33/35 (vì trên bộ kit PCR-ELISA do công ty Nam Khoa sản xuất, 3 genotype này được phát hiện trong cùng một giếng) , 3 genotype 11. Ngòai ra có 4 mẫu PCR-ELISA không cho được genotype dù giai đọan PCR cho kết quả [+] rất rõ và 1 mẫu kết quả PCR-ELISA dương tính v ới cả hai genotype 16 và 11 cũng được đưa vào thử nghiệm. Kết quả: Kết quả thu nhận được cho thấy các mẫu mà PCR-ELISA đã xác định là genotype 6, 11, 16, 18, và 58 thì kỹ thuật giải trình tự trực tiếp vùng gen L1 cũng cho kết quả định genotype hòan tòan tương đ ồng. 3 mẫu mà PCR-ELISA xác định là genotype 31/33/35 thì kết quả giải trình tự xác định là genotype 33. Với 4 mẫu PCR-ELISA không cho được kết quả genotype thì kết quả giải trình tự cho 1 mẫu là genotype 62, một mẫu là genotype 83, một mẫu là genotype 54, và 1 mẫu là genotype 52. Riêng mẫu PCR-ELISA cho kết quả dương tính cả hai genotype 16 và 11 thì giải trình tự không được dù kết quả PCR cho dương tính rất rõ. Kết luận: Với các kết quả này, các tác giả đã nhận định phương pháp giải trình t ự trực tiếp sản phẩm PCR có khả năng phát hiện được các genotype HPV mà bộ thử nghiệm PCR-ELISA chưa phát hiện được vì nhà sản xuất không cung cấp các dò đặc hiệu type tương ứng do số lượng giới hạn của các giếng được phủ dò đặc hiệu. Ngòai ra đối với nhà sản xuất bộ thử nghiệm PCR-ELISA thì phương pháp giải trình t ự trực tiếp để xác đ ịnh genotype của HPV cũng còn có thể giúp hòan thiện bộ thử nghiệm này nhờ cho biết thêm các genotype của HPV hiện đang lưu hành mà nhà sản xuất cần phải chọn thêm các dò đặc hiệu để phủ trên các giếng ELISA. Tuy nhiên trong trường hợp các mẫu bệnh phẩm có nhiễm nhiều genotype HPV thì phương pháp PCR-ELISA vượt tr ội hơn phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR. Trong các trường hợp này, nếu muốn đ ịnh genotype HPV bằng kỹ thuật giải trình tự, nhà nghiên cứu cần phải sử dụng phương pháp t ạo dòng khá t ốn kém và mất th ời gian. Abstract Genotyping of HPV by direct sequencing the PCR product specific to L1 gene of the virus Background: The Nam Khoa Biotek co. has developed the PCR-ELISA kit to detect and genotype of HPV from different clinical samples and this kit has been used usefullty at some clinical laboratories in Ho Chi Minh City. However, there have another approach to genotype of HPV, that is the direct sequencing of the PCR product of the L1 gene and align the detected sequence to the library of HPV genotype sequences to get the result of HPV genotyping. Objectives: Develop the direct sequencing of the PCR product specific to the L1 gene for genotyping of the HPV Methods: The authors have tried this approach to detect and genotype of HPV from 39 DNA samples extracted from the cervical swabs that were already confirmed the HPV genotype by PCR-ELISA including 5 genotype 6, 8 genotype 16, 7 genotype 18, 8 genotype 58, 3 genotype 31/33/35 (because in the PCR-ELISA kit produced by Nam Khoa Biotek Co., these 3 genotypes are detected in one ELISA well), 3 genotype 11. In addition, 4 samples that could not be defined the genotype by PCR-ELISA even though the PCR of PCR-ELISA were strongly positive, and 1 positive with both genotype 16 and genotype 11 detected by PCR-ELISA. Results: The received results demonstrated there were no difference between PCR-ELISA and sequencing in the detection and genotyping of the samples infected with single HPV genotype like: 6, 11, 16, 18, and 58. All 3 samples that were defined as 31/33/35 by PCR-ELISA were determined as genotype 33 by sequencing. However with 4 samples that could not be defined the genotype of HPV by PCR-ELISA, the sequencing has determined 1 was belong to genotype 62, one to genotype 83, one to genotype 54 and 1 to geotype 52. The sample that PCR-ELISA has detected as the mixed infection of 2 genotype 16 a ...