Xác định kiểu gen virus viêm gan B

Tham khảo tài liệu xác định kiểu gen virus viêm gan b, y tế - sức khoẻ, y học thường thức phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xác định kiểu gen virus viêm gan B Xác định kiểu gen virus viêm gan BNhững tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử vào những năm cuối thế kỹ 20 đãgiúp khám phá ra sự đa dạng trong trình tự chuỗi của vi rút viêm gan B, và từ đómột dấu ấn (marker) mới của HBV ra đời là HBV genotype.Tám kiểu gen của HBV đã được xác định (Từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên8% của toàn bộ trình tự chuỗi của bộ gen HBV, và sự phân bố của các kiểu genkhác nhau ở các châu lục, các nước khác nhau.Tuy nhiên sự phân loại các HBV genotypes có thể chỉ cần dựa trên trình tự chuỗi(sequence) của một đoạn gen nào đó của HBV như trên một phần trình tự chuỗicủa gen pre-S; S. Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và dùng trong việcxác định HBV genotypes như giải trình tự chuỗi (sequencing), RFLP (RestrictionFragment Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay), phản ứng miễn dịchmen (Enzyme-linked Immunoassay).Mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm khác nhau, tuy nhiên phương phápgiải trình tự chuỗi có thể xem như có nhiều ưu điểm nổi bật vì bên cạnh việc xácđịnh được trình tự chuỗi các Nucleotids trong bộ gen của HBV để từ đó so sánhvới thư viện gen và xác định được HBV genotypes mà còn dựa vào kết quả giảitrình tự này chúng ta có thể xác định được một số dạng đột biến kháng thuốc củaHBV để từ đó có phát đồ điều trị tối ưu1. Khái niệm về cấu trúc phân tử DNADNA là một chuỗi xoắn kép, hai mạch đơn được nối với nhau bằng liên kếtHydro. Mối liên kết này có thể bị phá vỡ bởi nhiệt độ cao (Thường là trên 90oC,và ứng dụng thực tế là 940C), làm cho phân tử DNA biến thành 2 mạch đơn. Có 4loại Nucleotid (Nu ) căn bản cấu tạo nên DNA: A(Adenine), T(Thymine),G(Guanine), C(Cytosine).Việc xác định được thứ tự các Nu gắn kết với nhau dọc theo chiều dài của bộ gen(DNA) gọi là việc giải trình tự chuỗi (Sequencing), và trình tự gắn kết nhau củacác Nu gọi là trình tự chuỗi (Sequence).2. Cấu tạo bộ gen HBVHBV có bộ gen là phân tử DNA, chiều dài khoảng 3200 bases. Hoạt động nhânđôi của HBV nhờ hoạt tính của men polymerase. Trên vùng gen P (Polymerase)được chia làm 4 vùng, mỗi vùng có một chức năng riêng: Terminal protein,Spacer, RT domains và RNAase H .Trong đó, vùng sao mã ngược (RT domains: Reverse Transcription) chịu tráchnhiệm cho việc tổng hợp men RNA-dependent DNA và DNA-dependent DNAđược chia ra thành 7 vùng đặt tên từ A – G. Vì vùng RT là đích tác động của thuốcLamivudine nên những đột biến của vùng này trong quá trình phát triển tự nhiêncủa siêu vi B cũng như dưới tác động của thuốc điều trị sẽ dẫn tới vấn đề đột biếnkháng thuốc.3. Quy trình giải trình tự chuỗi:Thực hiện PCR: Để khuếch đại gene của HBV ta dùng kỹ thuật PCR (PolymeraseChain Reaction: Phản ứng trùng hợp chuỗi) . Mục đích của giai đoạn này làkhuếch đại đoạn gen đặc hiệu cho HBV có ở trong máu bệnh nhân: Từ một phântử ban đầu thành hàng tỷ bản sao DNA, từ đó mới thực hiện được giải trình tựchuỗi của HBV. Đây là giai đoạn quan trọng, quyết định cho sự thành công khithực hiện giải trình tự chuỗi. Một chu kỳ của phản ứng PCR gồm có 3 giai đoạn:Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ của ống mẫu sẽ được tăng lên đến 94o C, làm chophân tử DNA biến tính tách ra làm đôi hoàn toàn, tất cả hoạt động của các menđều dừng lại, phân tử DNA duỗi thẳng ra ho àn toàn, từ đó dễ dàng cho việc bắtcặp và gắn các Nu vào mạch đơn đó theo nguyên tắc bổ sung.Giai đoạn bắt cặp: Các Primer (Các đoạn mồi) có gắn Biotin là các đoạn Nu ngắn(Khoảng 20-25 Nu) có sẵn trong ống mẫu sẽ bắt cặp vào các chuỗi đơn DNA saukhi biến tính theo nguyên tắc bổ sung. Sự bắt cặp này sẽ có 2 ý nghĩa đặc hiệu:Đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung với đoạn gen mà ta cần khuếch đại và đặc hiệutheo chiều dài của đoạn gen khuếch đại.Giai đoạn kéo dài: Sau khi primer bắt cặp đặc hiệu với các mạch đơn DNA, nhờtác dụng của men Taq polymerase ở điều kiện thích hợp sẽ gắn các Nu có sẵntrong ống nghiệm vào các primer theo nguyên tắc bổ sung, từ đó làm cho đoạnmồi dài ra và hình thành nên một mạch đơn mới bổ sung với mạch đơn cũ. Và mộtbản sao DNA mới đã được hình thành. Như vậy, sau giai đoạn này ta có được haiphân tử DNA có cấu trúc giống hệt như phân tử DNA ban đầu.Như vậy, sau mỗi chu kỳ khuếch đại thì từ một phân tử DNA ban đầu sẽ thành 2phân tử DNA giống hệt nhau, và sau 30 chu kỳ khuếch đại ( thời gian khoảng 2 –3h ) sẽ có khoảng 230 phân tử DNA giống hệt nhau (Khoảng 1 tỷ DNA), lượngDNA này đủ để ta làm phản ứng cắt cho giải trình tự chuỗi.Sau khi đã thực hiện phản ứng PCR, ta điện di trên gel agarose 2%, mục đích chủyếu của bước này là xem có sản phẩm của PCR không và đánh giá kích thước củasản phẩm khuếch đại có đúng là đoạn dài như ta đã biết (Có nghĩa là có bắt cặpcủa primer và chiều dài của amplicon đúng cho HBV).Thực hiện phản ứng cắt: Nguyên tắc của phản ứng này giống hệt phản ứng PCR.Tuy nhiên có một điểm khác căn bản là thành phần các Nu trong Cli ...