Xác định staphylococcus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và MPN

- Mannitol là nguồn Carbonhydrate duy nhất để vi khuẩn lên men. Trên môi trường thạch Mannitol muối, S. aureus cho khuẩn lạc màu vàng, còn S. epidermidis (không lên men Mannitol) sẽ cho khuẩn lạc màu đỏ.- Môi trường thạch máu: máu được sử dụng là máu cừu hay máu bê non dưới 5 tháng tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung chất chống đông citrate. Môi trường cần được pha trước 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xác định staphylococcus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và MPN Xác định staphylococcus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và MPN12.1.1. Nguyên tắc: S.aureus được xác định dựa trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng huyết tương của cácdòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập.2.1.2. Môi trường và thuốc thử: - Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): môi tr ường này được dùng để định tính S.aureus haycũng có thể dùng trong định lượng bằng phương pháp Most Probable Number (MPN). - Môi trường thạch Mannitol muối – Mannitol Salt Agar (M35): Nếu không sử dụng môi trường thạchBaird – Parker, ta có thể sử dụng môi trường thạch Mannitol muối. Thành phần chính của môi trường nàygồm có peptone, chất chiết từ thịt bò, Mannitol, NaCl và Phenol đỏ. Nồng độ muối trong môi trường khácao (7,5%) sẽ ức chế sự sinh trưởng của nhiều loài vi sinh vật. - Mannitol là nguồn Carbonhydrate duy nhất để vi khuẩn l ên men. Trên môi trường thạch Mannitolmuối, S. aureus cho khuẩn lạc màu vàng, còn S. epidermidis (không lên men Mannitol) sẽ cho khuẩn lạcmàu đỏ. - Môi trường thạch máu: máu được sử dụng là máu cừu hay máu bê non dưới 5 tháng tuổi đã được loạibỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung chất chống đông citrate. Môi trường cần được pha trước 2 ngàytrước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm. - Môi trường thạch Braid Parker Agar (BPA): là môi trường chọn lọc thường sử dụng để phát hiệnS.aureus. Môi trường có chứa pepton và chất chiết thịt bò là những thành phần dinh dưỡng cơ bản.Glycine và sodium pyruvate có chức năng kích thích sự sinh tr ưởng của vi khuẩn. Lithium chloride vàpotassium tellurite được sử dụng để ức chế vi khuẩn Gram âm và làm chậm sự sinh trưởng của vi khuẩnGram dương khác. Lòng đỏ trứng được cho vào môi trường để phát hiện khả năng sinh tổng hợplycithinase của S.aureus. - Lưu ý: lòng đỏ trứng và potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khi đã khử trùng vàlàm nguội đến khoảng 60oC. Tụ cầu sinh tổng hợp coagulase trên môi trường này sẽ có màu đen. Sự sinhtổng hợp lecithinase của vi khuẩn sẽ tạo nên vòng sáng xung quanh các khuẩn lạc. - Môi trường dịch thể tim óc-Braid heart infusion broth (M36): thành ph ần cơ bản của môi trường gồmóc bê, tim bò, peptone, glucose và mu ối NaCl. Đây là môi trường giàu dinh dưỡng được sử dụng để thúcđẩy sự sinh trưởng của nhóm vi sinh vật có nhu cầu về dinh dưỡng. - Huyết thanh thỏ có bổ sung ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA): đ ược sử dụng để kiểm tra hoạttính coagulase của vi khuẩn. Huyết thanh thường được cung cấp ở dạng đông khô. EDTA có chức năngnhư một tác nhân chống đông tụ. Quá trình hoàn nguyên huy ết thanh được thực hiện theo khuyến cáo củanhà sản xuất.2.1.3. Phương pháp:2.1.3.1. Phân tích định tính S.aureus: - Cấy 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MBS, trộn đều và ủ ở nhiệt độ 37oCtrong 24 giờ. - Dùng que cấy vòng, cấy ria dịch mẫu từ ống d ương tính (môi trường chuyển từ đỏ sang vàng) lênmôi trường phân lập là thạch TGA hay thạch Baird Perker, ủ ở 37oC trong 24 giờ. - Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường phân lập tròn, lồi, có tâm đen, trong suốt,đường kính 1-1.5mm, có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc. - Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ống môi trường BHI, ủ 37oC 24 giờ. - Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0.3ml huyết tương và ủ ở 37oC trong 24 giờ để thử phản ứngđông kết. - Thực hiện song song một ống đối chứng không đ ược cấy dịch vi sinh vật. Mẫu được kết luận là cóS.aureus khi thử nghiệm coagulase này dương tính (nghĩa là có sự xuất hiện của khối đông trong khi ốngđối chứng thì không có).22.1.3.2. Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:a./ Đồng nhất mẫu pha loãng: Cân chính xác 10 ± 0.1g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng, đồng nhất bằngmáy dập mẫu 30s. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu saocho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc / đĩa.b./ Phân lập trên môi trường chọn lọc: - Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker. Dùng que cấy tamgiác thủy tinh ( thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô. Thực hiện lập lại3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi loại pha loãng. Thực hiện tương tự với môi trường thạchmáu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 10C trong 24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môitrường thạch máu. - Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính 0,5 – 1 mm, lồi ,đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh. - Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ 48 giờ. Sau 48 giờkhuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, có màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp vàvòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. Aureus có thể không tạo cácvòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đến và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc. - Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S.aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi, có màu xámhay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 – 2µm. Hầu hết S. Aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòngkhông tạo vùng tan máu này.c./ Khẳng định: - Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường BairdParker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ± 10C trong 24 giờ. - Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã rã đông, ủ ở 37± 10C. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2,4,6,8 và 24 giờ. Tính tỉ lệkhẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặctrưng trên môi trường thạch máu. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành (mọimức độ đông kết đều đ ược xem ...