Ảnh hưởng của các liều heat shock protein lên các thông số miễn dịch của tôm sú

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của các liều khác nhau của protein sốc nhiệt ly trích từ vi khuẩn (DnaK) lên đáp ứng miễn dịch của tôm sú. Khả năng đáp ứng miễn dịch của tôm được kiểm tra bằng phản ứng Phenoloxidase thực hiện trên cuvet, so màu bằng quang phổ kế ở bước sóng 492nm và phản ứng định lượng Real-time PCR.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Ảnh hưởng của các liều heat shock protein lên các thông số miễn dịch của tôm sú VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LIỀU HEAT SHOCK PROTEIN LÊN CÁC THÔNG SỐ MIỄN DỊCH CỦA TÔM SÚ Lê Hồng Phước1*, Nguyễn Hồng Lộc1, Nguyễn Thị Hiền1, Võ Hồng Phượng1 TÓM TẮT Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của các liều khác nhau của protein sốc nhiệt ly trích từ vi khuẩn (DnaK) lên đáp ứng miễn dịch của tôm sú. Khả năng đáp ứng miễn dịch của tôm được kiểm tra bằng phản ứng Phenoloxidase thực hiện trên cuvet, so màu bằng quang phổ kế ở bước sóng 492nm và phản ứng định lượng Real-time PCR. DnaK được ly trích từ chủng vi khuẩn E. coli có khả năng biểu hiện DnaK gắn với hexahistidine sau đó được tinh sạch bằng bộ kít dưới tác dụng của các hạt từ Dynabead. Lượng DnaK ly trích được kiểm tra bằng phương pháp Bradford. DnaK sau đó được trộn với dung dịch đệm nạp mẫu và điện di trên bản gel 10% SDS-PAGE. Gel sau khi điện di được nhuộm với Bio-safe Coomassie stain (phản ứng SDS-PAGE) hoặc chuyển qua màng lai cho phản ứng với kháng thể đặc hiệu cho DnaK (phản ứng Western Blot). Tôm sú có trọng lượng trung bình 10-12g được tiêm với các liều khác nhau của DnaK (2, 4, 6, 8, 10 hoặc 15µg/tôm), máu tôm được thu ở các thời điểm 2, 4, 7 và 10 giờ sau khi tiêm DnaK. Biểu hiện của gen prophenoloxidase được kiểm tra bằng phản ứng định lượng real-time PCR. Tôm được tiêm với 8 hoặc 10 µg DnaK làm tăng biểu hiện của Prophenoloxidase (proPO) tại thời điểm 2 và 4 giờ sau khi tiêm và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức khác (p < 0,05). Kết quả này cho phép kết luận DnaK có khả năng điều khiển đáp ứng miễn dịch trên tôm sú. Từ khóa: DnaK, tôm sú, HSP70, prophenoloxidase. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu gần đây cho thấy nhiệt độ gây Heat shock protein (Protein sốc nhiệt hay sốc không gây chết kích thích sinh ra lượng HSP Hsp) là loại protein được sinh trong quá trình làm tăng khả năng đáp ứng với hiện tượng nhiễm sốc do nhiệt hoặc do các yếu tố khác như thay khuẩn của động vật không xương sống (Singh và đổi đột ngột các yếu tố môi trường sống (pH, Aballay, 2006). Theo Campisi và ctv., (2003), khi độ mặn,...). Hsp được Ritossa khám phá đầu tiếp xúc với các yếu tố gây sốc mạnh sẽ làm tăng tiên vào năm 1962 trên ruồi dấm Drosophila cường Hsp72 ở chuột. Đây được xem là một dấu melanogaster. Tuy nhiên, mãi đến năm 1974 thì hiệu báo động kích thích các phân tử NO hoạt mới có tên gọi chính thức là Hsp. Theo Lindquist động để chống lại vi khuẩn và làm tăng cường và Craig (1988), HSP được tìm thấy trên hầu hết khả năng phục hồi từ nhiễm khuẩn. các cơ thể sinh vật. Hsp chiếm từ 5-10% trên Nghiên cứu trên cá hồi, Sergio và ctv., tổng protein của tế bào bình thường và có thể (2007) tìm thấy tiềm năng của Hsp như là kháng tăng lên gấp 2-3 lần khi gặp phải các yếu tố gây nguyên kích thích sinh miễn dịch. Kết quả kiểm sốc như nóng, lạnh, thiếu dinh dưỡng, thiếu ôxy tra bằng phản ứng ELISA cho thấy kháng thể hoặc là nhiễm bệnh (Pockley, 2003). Căn cứ trên trong huyết thanh của cá nhiễm Piscirickettsia trọng lượng phân tử, HSP được phân làm nhiều salmonis cho phản ứng dương tính với Hsp được nhóm như Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90,...Một trích từ loài vi khuẩn này. Do đó nhóm nghiên trong những nhóm Hsp được nghiên cứu nhiều cứu này cho rằng Hsp có thể được sử dụng như là Hsp70. là vaccine để kích thích sinh kháng thể. Trung Tâm Quan Trắc Môi Trường & Bệnh Thủy Sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 *Email: lehongphuoc@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 25 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Hsp đã được nghiên cứu ở lĩnh vực bệnh khuẩn (DnaK) lên khả năng đáp ứng miễn dịch trên đối tượng thủy sản thông qua việc sử dụng của tôm sú ấu trùng Artemia franciscana nuôi trong điều II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP kiện vô trùng như là một mô hình mẫu để gây NGHIÊN CỨU bệnh thực nghiệm với vi khuẩn. Quy trình sốc 2.1. Ly trích và tinh sạch DnaK nhiệt không gây chết nhưng có tác dụng kích thích sản sinh Hsp70 ở Artemia đã được tối ưu DnaK được ly trích và tinh sạch từ chủng hóa. Cụ thể là ấu trùng Artemia nuôi ở 28°C vi khuẩn E. coli có khả năng biểu hiện DnaK khi được gây sốc ở 37°C trong 30 phút sau đó gắn với hexahistidine. Bước đầu tiên của ly là 6 giờ cho khoảng thời gian hồi phục rồi kiểm trích DnaK là cấy E. coli từ ống giữ giống lên tra khả năng đề kháng của Artemia đã được gây đĩa thạch Luria-Bertani (LB) và ủ ở 37°C trong sốc với Vibrio campbellii. Kết quả cho thấy quy 24 giờ sau đó chọn khuẩn lạc và cấy tăng sinh trình này tăng cường khả năng kháng Vibrios trên môi trường lỏng LB đến pha log (mật độ gây bệnh trên ấu trùng Artemia được gây sốc quang OD600 nm = 0,4 - 0,6). Việc kích thích sinh nhiệt. Tỷ lệ sống tăng gấp đôi ở nhóm được gây DnaK protein được thực hiện bằng cách thêm sốc nhiệt so với nhóm đối chứng chứng tỏ rằng đường L-arabinose (0,5 mg/ml) sau đó tiếp tục Hsp70 có vai trò bảo vệ Artemia đối với tác ủ ở 37°C trong 4 giờ. Toàn bộ vi khuẩn tăng nhân gây bệnh (Yeong và ctv., 2007, 2008). sinh được chuyển qua ống falcon vô trùng ly ...