Bài 1: NUÔI CẤY MÔ, TẾ BÀO THỰC VẬT

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là sự nuôi cấy in vitro: tế bào đơn hoặc mô hay cơquan… trong điều kiện vô trùng. Các môi trường nuôi cấy mô thực vật, dụng cụ thủy tinh được khử trùngbằng nhiệt ẩm bởi autoclauve ở 1210C, áp suất 1,05kg/cm3. Thời gian khử trùngphụ thuộc vào thể tích của môi trường trong vật chứa.Dụng cụ cấy bằng kim loại được khử trùng bằng nhiệt khô trong tủ sấy từ130-1700C từ 2-4 giờ. Trong khi cấy, các dụng cụ cấy được đốt nóng bởi đèncồn hoặc máy....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài 1: NUÔI CẤY MÔ, TẾ BÀO THỰC VẬTBài 1: NUÔI CẤY MÔ, TẾ BÀO THỰC VẬTI. Định nghĩa : Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là sự nuôi cấy in vitro: tế bào đơn hoặc mô hay cơquan… trong điều kiện vô trùng.II. Sơ lược về nuôi cấy mô1. Phương pháp khử trùng môi trường nuôi cấy, dụng cụ thủy tinh và dụngcụ cấy: Các môi trường nuôi cấy mô thực vật, dụng cụ thủy tinh được khử trùngbằng nhiệt ẩm bởi autoclauve ở 1210C, áp suất 1,05kg/cm3. Thời gian khử trùngphụ thuộc vào thể tích của môi trường trong vật chứa. Dụng cụ cấy bằng kim loại được khử trùng bằng nhiệt khô trong tủ sấy từ130-1700C từ 2-4 giờ. Trong khi cấy, các dụng cụ cấy được đốt nóng bởi đèncồn hoặc máy.b. Khử trùng phòng nuôi cấy, tủ cấy: Phòng nuôi cấy mô thường được khử trùng bằng tia cực tím (UV) khi khôngcó người trong phòng. Ngoài ra, phòng thí nghiệm có thể được xông bằngfolmaldehyde kết hợp với KMnO4 và được trung hòa bởi NH3. Tủ cấy được khử trùng bằng cách mở dòng khí liên tục, lau các bề mặt tủcấy bằng cồn 700, bật đèn UV từ 15-20 phút trước khi cấy.c. Khử trùng mô thực vật Các mô thực vật được rửa sạch bằng xà phòng cho thật sạch; rửa dưới vòinước chảy cho hết xà phòng. Sau đó, mô cấy ngâm trong cồn 700 3 phút. Mô thựcvật được ngâm trong dung dịch khử trùng canxihypocloride 10% trong 15 phút.Rửa nước cất vô trùng 3 lần trong tủ cấy.d. Kiểm soát sự nhiễm khuẩn và nấm trên môi trường nuôi cấy Sau khử trùng, môi trường nuôi cấy được giữ từ 5-7 ngày để theo dõi sựphát triển của vi khuẩn và nấm mốc. Sau thời gian đó, các môi trường mới đượcđưa vào cấy mẫu.2. Cách tiến hànha. Môi trường nuôi cấy: Có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô, phổ biến nhất là môi trường MS, N6, SH, AA. Môi trường nuôi cấy thường được pha với nồng độ đậm đặc – gọi là dung dịch mẹ hay dung dịch Stock- hơn so với lượng cần dùng trong 1 lít để khỏi mất thời gian pha chế nhiều lần. Môi trường MS: Đo pH 5,8; bổ sung đường 30g/l; agar 6-7 g/l. Nấu môi trường cho tan agar.Đổ môi trường vào ống nghiệm hoặc erlen. Đậy miệng ống nghiệm hoặc erlenbằng bông không thấm hoặc giấy nhôm, dùng giấy dầu không thấm nước đậylên trên. Đem hấp vô trùng các ống nghiệm, erlen có chứa môi trường bằng nồi hầpvô trùng autoclauve nhiệt độ 1210C, áp suất 1,2atm trong 15-20 phút. 0.1mg/l NAA (pha trong NAOH 1N). 2.5 mg/l BA (pha trong NAOH 1N).b. Thí nghiệm: Đối tượng nuôi cấy là nụ của hoa cúc. Chọn các nụ (10 nụ) không non quá, cũng không già quá, cho vào Erlen, rửabằng xà phòng, rửa bằng nước máy nhiều lần cho sạch.ngâm trong cồn 3 phút.Gạn sạch hết cồn, tiếp tục ngâm trong dung dịch khử trùng canxihypocloride10% trong 15 phút.Đem mẫu vào phòng cấy mô. Trước khi tiền hành cấy trên tủ cấy vô trùng, phải khư trùng 2 tay ngườicấy bằng cồn 700 đưa Erlen chứa chồi ngủ vào tủ cấy, bật đèn cồn lên, vô trùngđĩa Perti bằng đèn cồn. Dùng kẹp đã vô trùng lấy các mẫu chồi cho vào đĩa Petri,cắt bỏ phần vỏ nụ bên ngoài bằng dao cắt vô trùng, xẻ đôi nụ ra, rồi dùng kẹpđưa nụ đã cắt vào ống nghiệm, bịt kín miệng ống nghiệm sau khi cấy bằng bônggòn. Cứ như vậy cho đến khi cấy hết 5 nụ vào 5 ống nghiệm, đặt nuôi trongđiều kiện 270C, thời gian chiếu sáng 16giờ/ngày; độ ẩm 80%. Giữ trong 5-7 ngàytiến hành quan sát sự phát triển của nụ và kiểm tra sự nhiễm khuẩn và nấm trênmôi trường nuôi cấy.III. Kết quả thí nghiệm : Hình: ống nghiệm nuôi cấy môKết quả: • ống sống: 3 • ống chết: 1 • ống nhiễm: 1IV. Nhận xét và giải thích kết quả :- Trong 5 ống nghiệm có 3 ống sống, 1 ống chết, trong đó có 1 ống bị nhiễm.- Mẫu chết là do : Thao tác làm thí nghiệm, que cấy quá nóng, mẫu quá nonnhưng khử trùng trong canxi hypocloride 10% quá lâu, khử trùng mẫu không tốtlàm mẫu bị tổn thương. Ngoài ra còn nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến quá trìnhnuôi cấy như: môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy ...- Mẫu bị nhiễm là do : Thao tác làm thí nghiệm trong quá trình cấy, dụng cụ cấyvà mẫu cấy chưa được vô trùng tuyệt đối.V. Sơ lược về hoa cúc : Tên khoa học Chrysanthenum họ cúc (Compositeae) composite: có nghĩa làhợp lại. Để giải thích một bông hoa cúc vốn gồm nhiều hoa nhỏ hợp lại trên mộtcuống hoa, hình thành hoa tự đâu trang mà mỗi cánh thực chất là một bông hoa, ̀cây hoa cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và một số nướcChâu Âu (nó được người Trung Quốc, Nhật Bản và các cụ ta xưa rất quý trọng,coi nó những người bạn tâm tình, một thứ hoa quân tứ, dáng hoa đẹp, mùi thơmdịu và kín đáo, thơm cả lá và cành. Hoa của cây cúc được gọi là “ head” (đầu). Đó là một khối bao gồm nhiềuhoa đơn chụm vào nhau trông giống như một hoa đơn nở. Một khối lá bắc(bract)màu xanh chen chúc bao quanh hoa đầu. Hoa đầu lại có vòng hoa phía ngoài(chiếchoa tỏa tia = hoa hình môi), phân biệt với mắt lồi phía bên trong hoa ...