Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào: Bài 4 - ThS. Nguyễn Thành Luân

Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào Bài 4 Các qui trình kiểm tra vi sinh vật truyền thống và phi truyền thống nêu sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp. Trực tiếp như đếm trên kính hiển vi.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào: Bài 4 - ThS. Nguyễn Thành Luân 4/01/2013 BÀI 4 CÁC QUI TRÌNH KIỂM TRA VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG VÀ PHI TRUYỀN THỐNG Lớp phân tích vi sinh GV: ThS. Nguyễn Thành Luân luannt@cntp.edu.vn Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật (Nhắc lại) Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp  Trực tiếp như đếm trên kính hiển vi  Gián tiếp thông qua:  Phương pháp đo độ đục  Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường xác định  Định lượng một cách thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn (MPN). 1 4/01/2013 Phƣơng pháp đếm trực tiếp • Ƣu điểm: Quy trình này cho phép xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật chứa trong mẫu. • Nhƣợc điểm: - Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết - Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu - Khó đạt được độ chính xác cao - Không thích hợp với huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp. Phƣơng pháp đếm trực tiếp THIẾT BỊ GÌ?? • Buồng đếm hồng cầu • Buồng đếm Breed • Kính hiển vi huỳnh quang 2 4/01/2013 Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc • Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp cho độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp • Số lượng khuẩn lạc tối ưu là trong khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc • Phương pháp này dễ sai số nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất ba đĩa. • Ƣu điểm: Độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu 3 4/01/2013 Phƣơng pháp MPN (Most Probable Number)  Là phương pháp định lượng vi sinh vật theo xác suất lớn nhất hiện diện trong 1 đơn vị thể tích mẫu  Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại Thông thường là lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp.  Số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của phương pháp này càng lớn. Phƣơng pháp đo độ đục • Là phương pháp gián tiếp xác định mật độ vi sinh vật. • Định lượng mật độ tế bào thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 – 610 nm. • Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng 4 4/01/2013 CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA • Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết cho định danh VSV • Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa. • Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV: • Cách truyền thống • Sử dụng các bộ KIT • Sử dụng các thiết bị tự động 5 4/01/2013 Thử nghiệm khả năng lên men • Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các nguồn CH của các VSV • Nguyên tắc: VSV sử dụng CH  tao acid  giảm pH môi trường • Các loại carbohydrate • Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose … • Dicarbonhydrate: sucrose, lactose … • Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose • Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO • Các loại đường rượu: chứa chức -OH 6 4/01/2013 Phenol Red Carbohydrate Broth Trypticase 10g NaCl 5g Cao thịt 1g Phenol red (7,2ml của dung dịch phenol red 0,25%) 0,018g Carbohydrate* 1g Hấp ở 115oC trong 15 phút Thử nghiệm khả năng lên men • Môi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm • VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH  thay đổi màu chất chỉ thị phenolred • Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng • Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ 7 4/01/2013 Thử nghiệm Citrate • Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy nhất. • Cở sở sinh hóa: • VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm hóa MT • VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MT Thử nghiệm Citrate Môi trường Simmon citr ...