Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 3.1 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng

Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 3.1 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng cung cấp đến học viên các kiến thức về một số kỹ thuật sử dụng trong chọn giống cây trồng; chiết tách, đánh giá độ sạch DNA; phương pháp PCR; điện di; giải trình tự DNA,... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 3.1 - TS. Vũ Thị Thúy HằngCHƯƠNG 3: Một số kỹ thuật sửdụng trong chọn giống cây trồng3.1 Chiết tách, đánh giá độ sạch DNA3.2 Phương pháp PCR3.3 Điện di3.4. Giải trình tự DNA3.1. Chiết tách và đánh giá độ sạnh DNA• Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ thành phần tạp nhiễm, quan trọng nhất là protein• Tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nulceic acid/protein)• Thu được DNA ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học• DNA tách chiết được dùng trong phân tích di truyền trong- Khoa học: DNA sử dụng trong rất nhiều ứng dụng, vd đưa DNA vào tế bào cho mục đích chẩn đoán;- Y học: là ứng dụng phổ biến: vd đánh giá độc tính của sinh sinh vật, xác định nguồn gây bệnh;- Nghiên cứu tội phạm: cần phục hồi DNACác bướcCó rất nhiều phương pháp tách chiết khác nhau, tất cảcác phương pháp gồm:• B1: Phá màng tế bào, màng nhân• B2: Loại protein và các tạp chất khác• B3: Thu hồi nucleic acid• Sự lựa chọn các phương pháp dựa trên nhiều yếu tố: A. Hàm lượng và khối lượng của DNA B. Yêu cầu về độ tinh sạch của DNA cho ứng dụng C. Thời gian và chi phí Nguyên tắc• Tách DNA khỏi các thành phần tế bào khác như proteins, lipids, RNA….• Trách làm đứt gãy đoạn dài DNA từ tác động cơ học hoặc các enzyme• Bất hoạt các enzyme trong TB (DNase enzymes) và ngăn chặn tác động làm ngắn/đứt gãy lên DNA là bước quan trọng trong tinh sạch DNA. DNases có thể được bất hoạt bằng sử dụng nhiệt hoặc các chất hóa trị/chelating agents. Tách chiết DNACác bước• Phá màng tế bào, màng nhân• Loại bỏ các tạp chất gồm Proteins RNA Các phân tử đa lượng khác• Kết tủa và thu hồi DNA B1. Phá vỡ màng tế bào, màng nhânNghiền tế bào, mô trong một hỗn hơp chất tẩy (SDS) và proteinaseđể phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trườngđồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA- Chất tẩy là chất lưỡng cực, sẽ kết hợp với portein màng và các phân từ phospholipid làm vỡ cấu trúc màng- Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơnB2. Loại bỏ các tạp chất • DNA được tách bỏ khỏi protein và các tạp chất sau khi nghiền mẫu. Phương pháp tách bỏ: a) Dùng hợp chất hữu cơ b) Các loại muốia) Loại bỏ bằng hợp chất hữu cơ• Thông thường dùng phenol:chloroform hoặc chloroform:isoamyl. Lắc mẫu trong dung dịch để biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid.• Khi có phenol, 3 lớp hình thành sau khi ly tâm: DNA nổi ở trên (aqueous phase), protein sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:chloroform. Thu hồi nucleic acid trong pha nướcb) Loại bỏ bằng muối• Ở nồng độ muối cao, protein bị mất nước, mất tính hòa tain và kết tủa• Thường sử dụng NaCl, KCH3CO2, NH4CH3CO2.• Protein kế tủa được loại bỏ bằng cách ly tâm• DNA nổi ở lớp trênB3: Kết tủa và thu hồi DNA - Nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và khi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn; - Kết tủa DNA: + dùng Ethanol tuyệt đối hoặc isopropanol + Các sợi DNA có thể được vớt bằng que hoặc khi ly tâm, DNA kết tủa ở đáy - Rửa DNA bằng 70% ethanol để loại bỏ các muối và isopropanol Tách chiết ADN Cối và chày Đĩa nghiền sứ Lấy mẫu láNgày nay, tách chiết ADN tự động “Geno-Grinder” – máy tách chiết ADN số lượng nhiềuĐánh giá kết quả tách chiết và độ tinh sạch• Nguyên tắc: Phương pháp đo quang phổ dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base Purine và Pyrimidine, độ hấp thụ này tỷ lệ với nồng độ DNA.• Nồng độ DNA có thể xác định bằng độ hấp thụ đo bằng máy quang phổ và so với đồ thị chuẩn của nông độ DNA đã biết trước• Đo độ hấp thụ của DNA ở bước sóng 260nm & 280nm được dùng để xác định độ tinh sạch của DNA - Độ tinh sạch DNA: A260/A280 ratio: 1.7 – 1.9 - Nồng độ DNA (μg/ml): A260 X 50 - Tổng số DNA: Nồng độ DNA X Tổng thể tích DNASpectrophotometer/Máy đo quang phổĐộ tinh sạch của DNA Kiểm tra DNA đứt gãy Chạy điện di trên agarose gel: DNA chất lượng tốt sẽ dịch chuyển và cho vạch như phân tử khối lượng lớn, với ít hoặc không có vệt mờ. DNA hấp thụ ánh sáng UV ở bước sóng 260 &280 nm & protein hấp thụ UV ở 280 nm. Mẫu DNA có tỷ lệ 260/280 là 1.8 thì nhìn chung không bị lẫn tạp protein.  Mẫu DNA bị lẫn tạp sẽ có tỷ lệ 260/280 < 1.8 3.2 Phương pháp PCR• Khái niệm:PCR = Polymerase chain reaction = chuỗi phản ứngtrùng hợp- PCR là kỹ thuật nhằm nhân bản phân tử ADN hoặcđoạn ADN nhất định, lặp đi lặp lại q ...