Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 3 - TS. Nguyễn Xuân Cảnh

Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 3 Các phương pháp nghiên cứu protein/ enzyme, cung cấp cho người học những kiến thức như: Tách chiết và tinh sạch protein/ enzyme; Sản xuất protein/ enzyme tái tổ hợp; Cải biến protein/ enzyme; Phân tích cấu trúc, dự đoán chức năng. Mời các bạn cùng tham khảo!
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 3 - TS. Nguyễn Xuân Cảnh 9/18/2020 Chương 3 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PROTEIN/ ENZYME Mục đích • Để làm gì? • Số lượng bao nhiêu? • Độ tinh sạch như thế nào? Đối tượng • Thu nhận từ đối tượng nào? • Đối tượng đó như thế nào? • Có thỏa mãn được “mục đích” không? Xây dựng quy trình • Cần những nhóm phương pháp? • Các phương pháp có tính khả thi không? • Nhóm phương pháp phù hợp nhất là gì? 1 9/18/2020Các nội dung chính trong nghiên cứu protein/ enzyme Tách chiết và tinh sạch protein/ enzyme • Phá tế bào • Loại bỏ tạp chất • Phân tách protein/ enzyme • Bảo quản protein/ enzyme Sản xuất protein/ enzyme tái tổ hợp • Tách dòng • Biểu hiện và tinh sạch Cải biến protein/ enzyme Phân tích cấu trúc, dự đoán chức năng Tách chiết và tinh sạch protein/ enzyme Protein ngoại bào Protein nội bào Loại bỏ tạp chất Phá vỡ tế bào Tinh sạch Định tính và định lượng Bảo quản 2 9/18/2020 Protein ngoại bào (Extracellular proteins)Những protein được tổng hợp trong tế bào sau đó tiết ra ngoài môitrường ngoại bào để thực hiện các chức năng sinh học của tế bào vàcơ thể: • Protein tham gia truyền tín hiệu ngoại bào: hormone, cytokine, chemokine • Các enzyme tiêu hóa: trypsin, pepsin • Protease ngoại bào: Cathesin • Kháng thể dịch thể Trypsin (EC3.4.21.4) và Chymotrypsine (EC3.4.21.1) 3 9/18/2020• Trypsin và chymotrypsin là 02 enzyme phổ biến của hệ tiêu hóa, sinh ra từ tuyến tụy sau đó tiết vào dịch ruột non.• Trypsin thuộc nhóm serine protease, nó thường cắt các chuỗi peptide tại vị trí cacboxyl của lysine hoặc arginine (ngoại trừ trường hợp sau amino acid này là proline).• Chymotrypsin thường cắt các liên kết peptide tại vị trí cacboxyl của một số amino acid kị nước có kích thước lớn như tyrosine, triptophan, phenylalanine Pepsin (EC3.4.23.1)• Pepsin thuộc nhóm aspartate protease, sinh ra ở trong dạ dày. Cùng với Trypsin và Chymotrypsin là 03 enzyme thuộc nhóm phân giải protein được tìm thấy dưới dạng tinh thể trong hệ tiêu hóa.• Pepsin thường cắt hiệu quả đối với các liên kết peptide tạo ra giữa Amino acid kị nước và Amino acid thơm như tyrosine, triptophan, phenylalanine. 49/18/2020 5 9/18/2020• Thu dịch nuôi cấy: Ly tâm  loại bỏ tế bào  Dịch enzyme ngoại bào• Ưu điểm: Nhanh, đơn giản, chi phí thấp 6 9/18/2020 Protein nội bào (Intracellular proteins)Phá vỡ tế bào: Tùy thuộc vào tính chất của mỗi loại tếbào mà sử dụng phương pháp phù hợp• Nghiền đồng thể• Siêu âm• Dùng áp suất• Nghiền với cát, hạt thủy tinh• Vortex mạnh với các hạt thủy tinh• Xử lý bằng enzyme: lysozyme• Sử dụng: chất hoạt động bề mặt (SDS) 79/18/2020 89/18/2020 9 9/18/2020 Các chất hoạt động bề mặt• Ionic (cation hoặc anion): SDS, LiDS Protein  các subunit (gây biến tính)  xác định Mw• Nonionic: Triton X-100, Tween 20  tách phức hợp protein (ít gây biến tính) (có khả năng kết tủa).• Zwiterionic: CHAPS  hạn chế protein-protein interaction  ít gây biến tính protein. Thao tác với protein enzyme• Ở nhiệt độ thấp 40C• Giảm thiểu các bước trong quy trình tách chiết, tinh sạch• Bảo quản trong các đệm chiết phù hợp và có mặt các chất ức chế protease (PMSF, EDTA)• Các chất thường dùng trong quá trình bảo quản (albumin, glycerol, PEG) 10 9/18/2020 Đệm tách chiết protein (Protein extraction buffer)Các thành phần thường gặp trong dung dịch đệm tách chiết protein:• PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride, 2 mM): Ức chế protease• HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, 50 mM , pH 7.5): Là phân tử lưỡng điện hữu cơ, dùng để tạo dung dịch đệm, duy trì pH.• EDTA (5 mM): Ức chế protease• EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid, 5 mM): tạo phức với một số ion kim loại như Ca2+, Mg2+. Thường sử dụng trong biểu hiện và tinh sạch protein.• Na3VO4 (Sodium orthovanadate, 1 mM): Là chất ức chế tyrosine phosphatases, alkaline phosphatases and ATPases.• NaF (25 mM): Là chất ức chế Ser/Thr and acidic phosphatases• DTT (Dithiothreitol, C4H10O2S2 , 2 mM): Cắt các liên kết disulfide trong phân tử protein• Glycerol (5%): Tạo môi trường ổn định cho protein• Triton X-100 (1%): Liên kết các cấu trúc màng• Chất ức chế protease khác Các chất ức chế protease (Protease inhibitors) Là các phân tử có khả năng úc chế hoạt động chức năng của protease, trong tự nhiên các chất ức chế này thường là các phân tử protein. ...