Bài giảng Kỹ thuật bảo quản tế bào

Dưới đây là bài giảng Kỹ thuật bảo quản tế bào, bài giảng giới thiệu tới các bạn kỹ thuật đông lạnh tế bào từ việc chọn dụng cụ đông lạnh tế bào, nguồn tế bào, các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng của tế bào đối với môi trường đông lạnh, các bước bảo quản lạnh tế bào và một số nội dung khác.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Kỹ thuật bảo quản tế bào KỸ THUẬTBẢO QUẢN TẾ BÀO ThS. Phan Lữ Chính Nhân PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc• Bảo quản ở nhiệt độ trên -130oC• Bảo quản ở nhiệt độ dưới -130oC• Đông khô ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO• Trữ ở nhiệt độ dưới -130oC• Tế bào ở dạng huyền phù• Tế bào dừng phân chia và các hoạt động trao đổi chất MỤC ĐÍCH• Giảm chi phí nuôi cấy và duy trì tế bào đồng thời bảo quản nguồn tế bào dự phòng – Tiết kiệm thời gian và hóa chất – Là cách thức thay thế cho việc nuôi cấy nhiều nguy cơ gây chết tế bào• Giảm sự thay đổi hay mất các đặc tính của tế bào – Giảm nguy cơ biến đổi di truyền – Ngăn sự già yếu tế bào – Ngăn quá trình biến đổi tế bào DỤNG CỤ - THIẾT BỊ ĐÔNG LẠNHNitơ lỏng – Không màu, không mùi, không dễ cháy, không độc – Nhiệt độ -196oC (thể lỏng) và -156oC (thể hơi)Thiết bị trữ lạnh – Tủ lạnh (4oC), tủ âm (-20oC, -80oC) – Thiết bị trữ lạnh bằng Nitơ lỏng (-196oC) Không kiểm soát nhiệt độCó kiểm soát nhiệt độ (Nicool) DỤNG CỤ - THIẾT BỊ ĐÔNG LẠNH Bể ổn nhiệtNhiệt độ trong bình trữ nitơ lỏng• Cryotube (cryovial, ampoule) NGUỒN TẾ BÀO• Loại/khả năng sống, tăng trưởng/sinh lí/số lượng/phương pháp tế bào được nuôi• Giai đoạn tốt nhất (log phase)• Chỉ đông lạnh những tế bào tăng sinh tốt và không nhiễm CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢNỨNG CỦA TẾ BÀO ĐỐI VỚI MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH1. Thể tích (V) và diện tích bề mặt tế bào (A)2. Tính thấm nước của tế bào (Lp)3. Loại và nồng độ chất bảo quản lạnh4. Tốc độ làm lạnh (B)CÁC BƯỚC BẢO QUẢN LẠNH• Tế bào và mô tiếp xúc với chất bảo quản (bước cân bằng)• Làm lạnh mẫu xuống nhiệt độ âm• Trữ ở nhiệt độ dưới -130oC• Làm ấm và giải đông• Pha loãng và loại bỏ các chất bảo quản lạnh trước khi tái nuôi cấy CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH• Sự hình thành tinh thể nước đá• Độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh• Tốc độ khử nước• Sự giảm thể tích của tế bào• Sự giảm hoạt động của enzyme• Độ pH của dung dịch• Sự hình thành bọt khíSỰ HÌNH THÀNH TINH THỂ NƯỚC ĐÁ4 yếu tố quyết định kiểu hình tinh thể nước đá • Nhiệt độ ở thời điểm biến đổi giai đoạn • Tốc độ làm lạnh • Thành phần các chất hoà tan trong dung dịch. • Nồng độ dung dịchĐỘ THẨM THẤU CỦA MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH Sự hình thành đá Nồng độ chất hòa tan tăng Áp suất thẩm thấu tăngTỐC ĐỘ KHỬ NƯỚC - Tínhthấm nước của màng tế bào - Năng lượng hoạt hóa của tính thấm nước - Tỉ lệ diện tích bề mặt / thể tích của tế bào SỰ GIẢM THỂ TÍCH CỦA TẾ BÀO- Tính thấm nước của màng tế bào và năng lượng hoạt hóa của tính thấm- Tốc độ làm lạnh- Thực tế và tính toán? HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME- Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa của các phân tử phản ứng.- Giảm- Tác hại đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt động của các protein – Vai trò của chất bảo vệ. ĐỘ pH DUNG DỊCH• Giảm theo nhiệt độ• Cân bằng acid-baz + Chất bảo vệ lạnh Glycerol: tính baz yếu DMSO: tính baz mạnh Propanediol, methanol + Nồng độ chất bảo vệ lạnh• Sự phù hợp về nhiệt độ và pH