Culture and Cryopreservation of Rat Ventral Mesencephalic Stem Cells

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm nuôi cấy tăng sinh và bảo quản lạnh thành công tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột cống trắng để tạo nguồn nơ ron tiết dopamin. Mời các bạn cùng tham khảo.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Culture and Cryopreservation of Rat Ventral Mesencephalic Stem CellsTẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017Nguyễn Phúc Hoàn*; Nguyễn Thị Bình*; Nguyễn Mạnh Hà*TÓM TẮTNghiên cứu được tiến hành nhằm nuôi cấy tăng sinh và bảo quản lạnh tế bào gốc não giữaphôi chuột cống trắng để tạo nguồn nơ ron tiết dopamin phục vụ điều trị bệnh Parkinson thựcnghiệm. Các tế bào gốc sàn não giữa phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi được phânlập và nuôi cấy trong môi trường cơ bản (DMEM/F12; 1:1) có bổ sung b-FGF2, EGF và một sốyếu tố tăng trưởng khác. Bảo quản lạnh các tế bào bằng môi trường cơ bản có bổ sung 10%DMSO. Sau 4 - 8 ngày nuôi cấy, thu được các nơ ron, tế bào sao, tế bào ít nhánh. Đa số tế bàonày dương tính với marker vimentin và một số nơ ron dương tính với marker thyroxin hydroxylase(TH) khi nhuộm hóa mô miễn dịch. Tỷ lệ sống của tế bào sau bảo quản lạnh 64,9%.* Từ khoá: Tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa; Nuôi cấy; Bảo quản lạnh.Culture and Cryopreservation of Rat Ventral MesencephalicStem CellsSummaryThe aim of this research was to culture and cryopreserve rat ventral mesencephalon cells totreat Parkinson’s diseases in rat. We have isolated rat ventral mesencephalic cells from ratembryonic days 12.5 - 13.5, then cultured them in the basic medium culture composed ofDMEM/F12; 1:1, supplemented with b-FGF2, EGF and growth factors. Then, harvest cells werecryopreserved in media with 10% DMSO. Neuron, astrocyte, oligocyte expressed after 4 - 8days in in vitro culture, some of them were positive with vimentine, TH by immunohistochemistrystaining. Survival cell rate after being frozen was 64,9%.* Keywords: Ventral mesencephalic stem cells; Culture; Cryopreservation.ĐẶT VẤN ĐỀTrong những năm gần đây, có nhiềukỹ thuật mới đ và đang được ứng dụngtrong tái tạo, sửa chữa hoặc thay thếmô hoặc cơ quan bị tổn thương. Một trongsố đó là ứng dụng công nghệ tế bào gốctrong trị liệu. Thực tế lâm sàng đ ứng dụngthành công công nghệ bảo quản lạnh tếbào gốc từ tủy xương, tế bào gốc trungmô hay tế bào gốc phôi… thời gian bảoquản lên tới vài chục năm với chi phí rẻvà kỹ thuật đơn giản. Khi cần người bệnhcó thể dùng tế bào gốc trên để điều trị cácbệnh như: bỏng, g y xương, teo cơ, tiểuđường, lơxemi, Alzeimer, Parkinson… [2].* Trường Đại học Y Hà NộiNgười phản hồi (Corresponding): Nguyễn Phúc Hoàn (phuchoan85@gmail.com)Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017Ngày bài báo được đăng: 01/09/2017Ý tưởng sử dụng tế bào gốc trong điềutrị bệnh Parkinson đ được bắt đầu từnhững năm 1980. Hơn thế nữa, việc cấy188ghép tế bào gốc có chức năng tiết dopaminvào n o động vật thực nghiệm cũng nhưtrên bệnh nhân Parkinson tình nguyện đTẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017có được nhiều thành công như: tế bào,mô sống tốt trong não sau ghép và có khảnăng tiết dopamin, cải thiện triệu chứngbệnh trên lâm sàng. Hiện nay, tế bào gốcthần kinh tiết dopamin được phân lập từnhiều nguồn: tế bào gốc não giữa phôi, tếbào gốc phôi giai đoạn sớm (phôi nang)hay gần đây là tế bào gốc vạn năng cảmứng và tế bào gốc cảm ứng tiết dopamin.Trong số này tế bào gốc não giữa phôivà tế bào gốc phôi giai đoạn sớm - phôinang - được sử dụng nhiều nhất. Vì vậy,song song với việc nuôi cấy để tăng sinhsố lượng tế bào cần thiết cho cấy ghép,việc lưu giữ, bảo quản lạnh tế bào rấtquan trọng để có sẵn nguồn tế bào và môtrong điều trị. Các kỹ thuật bảo quản lạnhkhông ngừng phát triển, đảm bảo đượcchất lượng của tế bào, mô và nâng caotỷ lệ sống của tế bào sau một thời giandài lưu giữ [3]. Với mục đích nuôi cấytăng sinh và lưu trữ lâu dài nguồn tếbào gốc ngoại bì thần kinh não giữa(TBGNBTKNG), chúng tôi đ tiến hànhnghiên cứu này với mục tiêu: Nuôi cấytăng sinh và bảo quản lạnh thành côngTBGNBTKNG phôi chuột cống trắng đểtạo nguồn nơ ron tiết dopamin.ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Đối tượng nghiên cứu.Chuột cống đực và cái trưởng thành.600 phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngàytuổi.2. Phương pháp nghiên cứu.* Tạo phôi:Nhốt chuột đực với chuột cái qua mộtđêm. Sáng hôm sau làm phiến đồ âm đạo,nếu thấy tinh trùng, chuột được tính có thai0,5 ngày.* Phân lập TBGNBTKNG:Mổ chuột lấy tử cung chứa phôi, táchrời từng phôi và phẫu tích lấy đoạn ốngthần kinh chứa não giữa. Tách bỏ lớpngoại bì da và màng não, phẫu tích lấysàn não giữa, sau đó dùng enzym dispasevà trypsin - EDTA để ly giải mô sàn nãogiữa. Tạo dịch treo tế bào bằng phươngpháp cơ học. Nhuộm dịch treo tế bào bằngtryphan blue để xác định tỷ lệ tế bào sốngvà mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu.* Nuôi cấy TBGNBTKNG:- Nuôi cấy dịch treo tế bào trong môitrường cơ bản: DMEM/F12 (1:1 - invitrogen,Mỹ) có bổ sung thêm các yếu tố: fetalbovin serum (FBS - invitrogen, Mỹ) 10%;insulin (25 ng/ml), progesteron (20 nM),putrescin (62 nM), muối selenit (30 nM);epithelial grow factor (EGF) 20 ng/mlvà basic fibroblast gro ...