Bài giảng Kỹ thuật cấy chuyền và tạo dòng

"Bài giảng Kỹ thuật cấy chuyền và tạo dòng" thông tin đến các bạn những kiến thức về nuôi cấy sơ cấp; nuôi cấy thứ cấp; cấy chuyền; cấy chuyền tế bào bám dính; tạo dòng, thu nhận dòng...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Kỹ thuật cấy chuyền và tạo dòng Đại học Quốc gia TP HCM Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Viện Tế bào gốcKỸ THUẬT CẤY CHUYỀN VÀ TẠO DÒNGCẤY CHUYỀN? Passage / SubcultureCẤY CHUYỀN When the cell density (cells/cm2 substrate) reaches a level such that allKhi nào thì cần cấy chuyền? of the available substrate is occupied, or when the cell concentration (cells/mL medium) exceeds the capacity of the medium, growth ceases or is greatly reduced. CẤY CHUYỀN Khi nào thì cần cấy chuyền?Cell Confluency (source: https://www.mirusbio.com/transfectopedia/methods)NUÔI CẤY SƠ CẤP NUÔI CẤY THỨ CẤPNuôi cấy thứ cấp là nuôi cấy tế bào được tính từ sau lần cấy chuyền đầu tiênSVF (stromal vascular fraction)trước khi được đưa vào nuôi cấylà một phức hợp gồm tế bào máungoại vi, MSC, tế bào tiền thân nộimô, tế bào cơ trơn, tế bào quanhmạch (pericyte), nguyên bào sợi,dưỡng bào, tế bào tiền thân tạomỡ,… [38, 115]. Sau vài thế hệcấy chuyền SVF trong điều kiệntiêu chuẩn, quần thể tế bào trởnên khá tương đồng của tế bàotrung mô – ASC [38]. Gentile, P., et al. (2012) Siennicka, K., et al. (2016) CẤY CHUYỀN Các bước cơ bản của cấy chuyền• HÚT BỎ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CŨ• RỬA BỀ MẶT GIÁ THỂ NUÔI (CÓ TẾ BÀO BÁM DÍNH)• TÁCH CÁC TẾ BÀO BÁM KHỎI BỀ MẶT DỤNG CỤ NUÔI• PHA LOÃNG CÁC TẾ BÀO BẰNG MÔI TRƯỜNG MỚISubculture of Monolayer. Stages in the subculture and growth cycle of monolayer cells after trypsinization Cấy chuyền tế bào bám dínhLoại bỏ môi trường khỏi bình nuôiRửa bề mặt bình nuôi với PBS- (free Ca2+Mg2+) Bổ sung dung dịch trypsin/EDTA (0,5- 3ml/bình) Ủ trong tủ ấm 370C Khi tế bào co tròn, nổi lên tiến hành bổ sung một lượng môi trường có chứa huyết thanh Rửa loại bỏ trypsin bằng cách ly tâm 1000- 3000 vòng/phút Tái huyền phù và pha loãng theo tỉ lệ thích hợp Expansion of Mesenchymal Stem Cells1.Subculture cells once they have reached approximately 80% confluence and are actively proliferating.IMPORTANT: Subculture cells before reaching 100% confluency.2.Carefully remove the medium from the 10-cm tissue culture plate containing the confluent layer of humanmesenchymal stem cells. Apply 3-5 mL of Trypsin-EDTA Solution (SM-2003-C) and incubate in a 37°C incubatorfor 3-5 minutes.3.Inspect the plate and ensure the complete detachment of cells by gently tapping the side of the plate with thepalm of your hand.4.Add 5 mL Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium (SCM015 or SCM045) to the plate.5.Gently rotate the plate to mix the cell suspension. Transfer the dissociated cells to a 15 mL conical tube.6.Centrifuge the tube at 300 x g for 3-5 minutes to pellet the cells.7.Discard the supernatant8.Apply 2 mL Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium (pre-warmed to 37°C) containing 8 ng/mL FGF-2 tothe conical tube and resuspend the cells thoroughly.IMPORTANT: Do not vortex the cells.9. Count the number of cells using a hemocytometer.10.Plate the cells at a density of 5,000-6,000 cells per cm2 into the appropriate flasks, plates, or wells inMesenchymal Stem Cell Expansion Medium containing 8 ng/mL FGF-2.11.Cells can be frozen in MSC growth media plus 10% DMSO (D2650) at a density of 2X106 cells/vial. CẤY CHUYỀN Các phương pháp tách tế bào lên khỏi bề mặt dụng cụ nuôi1. Trypsin/EDTA2. EDTA (EthyleneDiamineTetraAcetic)3. Scrape4. … CẤY CHUYỀNVai trò của trypsin/EDTA CẤY CHUYỀN Vai trò của EDTAC10H16N2O8  aminopolycarboxylic acid, colourless, water-soluble solid  able to sequester metal ions such as Ca2+ and Mg2+ CẤY CHUYỀN ScrapeScraper CẤY CHUYỀN Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền1. Density of Culture CẤY CHUYỀN Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền2. Exhaustion of Medium CẤY CHUYỀN Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền 3. Time Since Last SubcultureIdeally, a cell concentration should be foundthat allows for the cells to be subculturedafter 7 days, with the medium beingchanged after 3–4 days.(Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniqueand Specialized Applications, Sixth Edition) CẤY CHUYỀN Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền 4. Requirements for Other Procedures(1) cells should not be sub ...