Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng: Bài 5 – TS. Vũ Bích Ngọc

Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng: Bài 5 – TS. Vũ Bích Ngọc" trình bày kiến thức về bảo quản tế bào; nguyên tắc bảo quản tế bào bằng kỹ thuật đông lạnh; môi trường đông lạnh, chất bảo quản đông lạnh; nhiệt độ bảo quản lạnh; tốc độ làm lạnh, chuẩn hóa thời gian hạ nhiệt...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng: Bài 5 – TS. Vũ Bích Ngọc TS. Vũ Bích Ngọc-12/2/17 1 vbngoc@hcmus.edu.vnDịch vụ làm đông lạnh cơ thể người chết để chờ hồi sinh •  Gần 1000 người trên thế giới đã chọn cách bảo quản lạnh cơ thể sau khi chết để chờ cơ hội tái sinh trong tương lai. Khi khách hàng đã chết về mặt pháp y, nhân viên Alcor chuyển họ lên giường lạnh và dùng thiết bị hồi sức tim phổi làm cho máu lưu thông khắp cơ thể một lần nữa. Sau đó, họ sử dụng 16 loại thuốc khác nhau để giúp cho tế bào không bị hư tổn sau khi chết trước khi rút hết máu và dịch cơ thể rồi bơm chất lỏng bảo vệ nội tạng vào thay thế. Cuối cùng, các nhân viên tiến hành làm lạnh thi thể 0,5 độ C mỗi giờ cho đến khi đạt tới nhiệt độ của nitơ lỏng -160 độ C sau 2 tuần. Tiếp đó, họ cho các thi thể vào tủ đông lạnh hình trụ trong tư thế đầu lộn xuống. •  Sản xuất chất chống đông sugaryBọ cánh carbohydrate có tên xylomannan cứng (polymer đường của xylose và mannose sugars).Alaskan •  chịu được nhiệt -100 0C1949 Polge, Parks và Smith 1950 Smith GLYCEROL Sperm Human red blood cells 1959 Lovelock and Bishop Dimethyl sulfoxide- DMSO TĂNG CƯỜNG TÍNH THẤM•  là quy trình sinh học nhằm đảm bảo tính ổn định về mặt di truyền và cấu trúc nguyên vẹn của các tế bào sống; đảm bảo các thành phần như nucleic acid và protein của tế bào không thay đổi.•  Quá trình ổn định vật liệu sinh học ở nhiệt đô cực thấp được gọi là bảo quản đông lạnh.Hoạt động biến dưỡng tế bào ngưng lại là một điều kiện tiên quyết trong quytrình bảo quản tế bàoTất cả nước trong hệ thống bị chuyển đổi thành đá THÌ hoạt động biếndưỡng ngưngNguyên tắc bảo quản đông lạnh tế bào là làm cho tế bào mất đi một lượngnước nhất định nhằm hạn chế tình trạng đóng băng trong quá trình làm lạnh.Sử dụng chất bảo quản đông lạnh•  Áp lực chọn lọc khiến dòng tế bào bất ổn về đặc tính•  Sự giới hạn về khả năng tăng sinh của tế bào•  Sự bất ổn trong kiểu gen và kiểu hình•  Sự nhiễm chéo, nhiễm khuẩn trong nuôi cấy•  Sự tương đồng trong thí nghiệm•  Tiết kiệm thời gian và vật liệu Tốc độ Nhiệt độ làm lạnh Quy trìnhChất bảo đông lạnh- quản YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG rã đông ĐẾN SỐNG- CHẾT CỦA TẾ BÀOMôi trường đông lạnh-chất bảo quản ! Môi trường cơ bản: DMEM, IMDM, RPMI, …. ! Huyết thanh ! Kháng sinh ! Chất bảo quản (CPA): glycerol, DMSO VD: DMEM/F12; 20-40%FBS, 5-10% DMSO, 1% Antibiotic-antimycoticChất bảo quản đông lạnh (CPA)•  là chất được dùng để bảo vệ mô/tế bào khỏi các tổn thương do đông lạnh (tổn thương do tạo đá ).•  Các chất có thể thâm nhập dễ dàng vào tế bào và thường không độc hại cho tế bào. –  glycerol và DMSO được sử dụng rộng rãi –  giảm nồng độ các chất điện giải trong suốt quá trình đóng băng –  giảm mức độ co tế bào do thẩm thấu ở nhiệt độ thấp•  Các chất tan không thấm qua màng: đường và các hợp chất có phân tử lượng cao như polyvinylpyrrolidone, hydroxyethyl starch, polyethylen glycol và dextrans.•  chất bảo quản không thấm có thể góp phần tăng cường sự thuỷ tinh hoá dung dịch, ổn định protein và màng, ngăn chặn sự tiến triển trong hình thành tinh thể đá 4oC ——> 2 giờ -40oC ——> Một vài ngày -80oC ——> Một vài tháng -196oC một vài thế kỷNhiệt độ thấp có khả năng làm chậm thời gian hoặc thậm chí dừng lại thời gian” sinh học.•  -50C, cả tế bào và môi trường quanh nó chưa bị đóng băng.•  -50C đến -150C, đá ngoại bào hình thành. Tế bào ở trạng thái “siêu lạnh” (supercool)•  Ở thấp hơn -1200C, phản ứng hoá học không thể xảy ra đối với cơ thể sống.•  Ở -1960C, phản ứng liên quan đến nhiệt không thể xảy ra vì năng lượng nhiệt không đủ, do đó, tế báo có thể được lưu trữ ở nhiệt độ này trong nhiều thế kỷ. Tốc độ làm lạnhChuẩn hoá thời gian hạ nhiệt Bảo quản đông lạnh Đông lạnhBổ sung CPA Kiểm soát tốc độ Vận chuyển của nước Kiểm soát 2 Kết quả đông lạnh tiêu chí ...