BÁO CÁO HOÀN THIỆN QUI TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI VI RÚT GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Syndrome Virus) VÀ VI RÚT GÂY BỆNH CÒI (Monodon Baculovirus) Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) CÓ SỬ DỤNG GEN β-ACTIN LÀM NỘI CHUẨN

Qui trình mPCR phát hiện đồng thời WSSV, MBV trên tôm sú (Penaeus monodon) có sử dụng nội chuẩn được thực hiện và chuẩn hóa. Trên cơ sở qui trình PCR phát hiện WSSV của OIE (2006), qui trình PCR phát hiện MBV theo Belcher và Young (1998) và qui trình RT-PCR phát hiện gen β-actin ở tôm của Oanh (2008), qui trình mPCR phát hiện đồng thời WSSV, MBV và gen β-actin được thực hiện cho kết quả khuếch đại hiện đồng thời ba vạch ở vị trí 1447 bp (WSSV), 361 bp (MBV) và 216 bp (β-actin)....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO " HOÀN THIỆN QUI TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI VI RÚT GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Syndrome Virus) VÀ VI RÚT GÂY BỆNH CÒI (Monodon Baculovirus) Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) CÓ SỬ DỤNG GEN β-ACTIN LÀM NỘI CHUẨN "Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 233-240 Trường Đại học Cần Thơ HOÀN THIỆN QUI TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI VI RÚT GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Syndrome Virus) VÀ VI RÚT GÂY BỆNH CÒI (Monodon Baculovirus) Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) CÓ SỬ DỤNG GEN β-ACTIN LÀM NỘI CHUẨN Trần Việt Tiên1 và Đặng Thị Hoàng Oanh1 ABSTRACTA multiplex RT-PCR protocol for simultaneous detection of WSSV and MBV inblack tiger shrimp Penaeus monodon and to control false negative by detectingshrimp endogenous genes. Based on PCR protocols to detect WSSV from OIE(2006), MBV from Belcher và Young (1998) and RT-PCR protocol to detect β-actin endogenous gene from Oanh (2008), mPCR protocol for simultaneousdetection of WSSV, MBV and β-actin gen were developed with PCR product of1447 bp (WSSV), 361 bp (MBV) and 216 bp (β-actin). This mPCR protocol hasa practical application by using internal control β-actin and reduced cost andsave time as two viruses will be detected in a single PCR reaction.Keywords: Penaeus monodon, mPCR, WSSV, MBV, internal control.Title: Development of multiplex PCR protocol for simultaneous detection ofwhite spot syndrome virus and monodon baculovirus in black tiger shrimp(Penaeus monodon) by using β-actin gene as internal control. TÓM TẮTQui trình mPCR phát hiện đồng thời WSSV, MBV trên tôm sú (Penaeusmonodon) có sử dụng nội chuẩn được thực hiện và chuẩn hóa. Trên cơ sở quitrình PCR phát hiện WSSV của OIE (2006), qui trình PCR phát hiện MBV theoBelcher và Young (1998) và qui trình RT-PCR phát hiện gen β-actin ở tôm củaOanh (2008), qui trình mPCR phát hiện đồng thời WSSV, MBV và gen β-actinđược thực hiện cho kết quả khuếch đại hiện đồng thời ba vạch ở vị trí 1447 bp(WSSV), 361 bp (MBV) và 216 bp (β-actin). Kết quả đạt được cho thấy quitrình được thực hiện có thể phát hiện phát hiện đồng thời WSSV và MBV có sửdụng nội chuẩn trong cùng phản ứng vừa giảm được chi phí xét nghiệm khiphát hiện đồng thời WSSV và MBV vừa kiểm soát được trường hợp âm tính giảthường gặp khi sử sụng kỹ thuật PCR.Từ khóa: Penaeus monodon, mPCR, WSSV, MBV, nội chuẩn.1 Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ 233Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 233-240 Trường Đại học Cần Thơ1 GIỚI THIỆUNghề nuôi tôm ở nước ta đã và đang phát triển rất nhanh, đem lại lợi ích đángkể về mặt kinh tế và xã hội. Tuy nhiên khi nghề nuôi được thâm canh hóa thìdịch bệnh cũng xảy ra ngày càng nhiều. Trong đó nghiêm trọng nhất là bệnh dovi rút gây ra làm ảnh hưởng đến năng suất. Qua nhiều thập niên cho thấy bệnhdịch là nguyên nhân gây thất thoát trầm trọng về kinh tế trong nuôi thủy sản.Trong những năm thập niên 80, nền công nghiệp tôm nuôi ở châu Á, Thái BìnhDương và châu Mỹ gặp phải khó khăn do sự tác động mạnh mẽ dịch bệnh do virút gây nên. Hiện nay các tác nhân gây bệnh đã xuất hiện ở khắp nơi và có xuhướng ngày càng tăng. Những vi rút gây nhiều thiệt hại cho nghề nuôi tôm súlà vi rút gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus - WSSV), vi rút gâybệnh còi (Monodon Baculovirus - MBV), vi rút gây bệnh đầu vàng (YellowHead Virus - YHV)…. Hiện nay hiện tượng đa nhiễm trên tôm xuất hiện ngàycàng nhiều vì thế phát hiện sớm, phát hiện đồng thời mầm bệnh vi rút để chọngiống là một rong những biện pháp hữu hiệu trong quản lý bệnh tôm. Có nhiềuphương pháp được phát triển để phát hiện những loại vi rút này như mô học,nhuộm nhanh, phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR),lai tại chỗ (In situ hybridization). Trong đó PCR là phương pháp cho phép pháthiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Một dạng biến hoá của PCR làmultiplex PCR (mPCR), phương pháp này sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi đểkhuếch đại nhiều phân đoạn DNA trên một khuôn trong một phản ứng. Tuynhiên một trong những hạn chế đáng kể của PCR là hiện tượng âm tính giả.Trong số các qui trình PCR phát hiện vi-rút trên tôm trong đó có qui trình pháthiện MBV (Belcher và Young, 1998) được sử dụng không có nội chuẩn đểkiểm soát trường hợp âm tính giả. Để ngăn ngừa tổn thất do vi rút gây ra vàđồng thời từng bước khắc phục trường hợp âm tính giả chúng tôi phát triển quitrình mPCR phát hiện đồng thời WSSV, MBV và sử dụng gen β-actin làm nộichuẩn nhằm phát hiện sớm, chính xác và đồng thời WSSV và MBV để giảmchi phí phân tích và kiểm soát trường hợp âm tính giả do DNA ly trích có chấtlượng kém hay do lỗi thao tác khi thao tác PCR.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Mẫu vậtMẫu tôm nhiễm WSSV được xét nghiệm và cho kết quả dương tính bở ...