BÁO CÁO KHOA HỌC: HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA Equus caballus ANGIOGENIN

Angiogenin là một trong những protein tham gia vào quá trình kích thích sự hình thành và phát triển mạch máu mới (angiogenesis). Trình tự amino axít của angiogenin ở người giống 80% so với angiogenin ở chuột lang (1), 75% với angiogenin chuột nhà, 73% với angiogenin thỏ, 66% với angiogenin lợn và 64% với angiogenin bò (2).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA Equus caballus ANGIOGENIN" HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA Equus caballus ANGIOGENIN Nguyễn Hoài Giang Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ươngĐẶT VẤN ĐỀAngiogenin là một trong những protein tham gia vào quátrình kích thích sự hình thành và phát triển mạch máu mới(angiogenesis). Trình tự amino axít của angiogenin ở ngườigiống 80% so với angiogenin ở chuột lang (1), 75% vớiangiogenin chuột nhà, 73% với angiogenin thỏ, 66% vớiangiogenin lợn và 64% với angiogenin bò (2). Cấu trúc củaprotein angiogenin được chia làm bốn vùng chính: (i) vùng1 (trình tự FLxxHxDxxPxG) liên quan đến việc kìm hãmtổng hợp protein; (ii) vùng 2 (trình tựMxxRxxTxPCKxxNTF) liên quan đến quá trình di chuyểnvào nhân của protein này; (iii) vùng 3 (trình tựNGxPxxxxxRxSxSxFQxTTC) có vai trò quan trọng trongviệc kích thích mạch máu phát triển và có vị trí bám choactin; (iv) vùng 4 (trình tự GGSxxPPCxYxA) tham gia vàoquá trình kìm hãm hình thành các tiểu phần của tế bàoleukocyte (2). Những nghiên cứu trước đây đã chứng minhđược rằng angiogenin có hoạt tính ribonuclease, có khảnăng kích thích tế bào máu di chuyển, phân chia và khảnăng kích thích mạch máu phát triển in vivo (2, 3, 4).Sử dụng phương pháp tách dòng phân tử của gen mới vàthường qui để tinh sạch protein tái tổ hợp tương tự như ởangiogenin của chuột lang (1), tác giả đã thành công trongviệc tìm ra gen mã hoá cho angiogenin ở ngựa (Equuscaballus). Trình tự của gen này được lưu giữ tại ngân hàngdự liệu gen thế giới (Genbank) với số hiệu AY450362.Trong bài báo này, tác giả muốn giới thiệu các kết quảnghiên cứu về hoạt tính sinh học của protein angiogenin táitổ hợp này.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUĐối tượng: Protein tái tổ hợp angiogenin của ngựa đã đượctinh chế và các tế bào máu từ cuống rốn (Human UmbilicalVein Endothelial Cells - HUVE).Phương pháp nghiên cứu- Sử dụng điện di zymogram để xác định hoạt tínhribonuclease (4, 5).- Sử dụng Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit(Calbiochem) để phát hiện tế bào chết theo chương trình.- Sử dụng kỹ thuật Chorioallantoic Membrane (CAM) đểphát hiện sự kích thích tạo mạch máu mới in vivo (6).KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN1. Hoạt tính ribonuclease của protein angiogeninProtein angiogenin có cấu trúc tương tự với RNase A và cókhả năng cắt RNA, nên chúng được xếp vào nhóm cácribonuclease với hoạt tính sinh học đặc biệt (RISBASES).Hoạt tính ribonuclease của angiogenin lại liên quan chặtchẽ đến khả năng kích thích mạch máu phát triển(angiogenesis) của protein này (2, 3). Do vậy, sau khi đượctinh chế qua các cột SPsepharose, heparin và C18,angiogenin của ngựa được kiểm tra hoạt tính ribonucleasebằng kỹ thuật điện di zymogram với cơ chất là poly(C) (4,5). Cũng tương tự như angiogenin của chuột lang, khi sửdụng 0,5 mg/ml poly(C) làm cơ chất, angiogenin của ngựathể hiện hoạt tính ribonuclease rất rõ ở 2 µg (Hình 1). Trêngel SDS-PAGE với poly(C) làm cơ chất, angiogenin củangựa còn tỏ ra có hoạt tính ribonuclease mạnh hơn so vớiangiogenin của chuột lang (thể hiện bằng khả năng phân cắtpoly (C) khi so sánh giếng 1 và 2 của hình 1). Như vậy,cũng như các angiogenin khác (người, bò, chuột lang …)angiogenin của ngựa có hoạt tính ribonuclease.Hình 1. Hoạt tính ribonuclease của angiogenin ở ngựa trên gel SDS-PAGE với cơ chất là poly(C). Giếng 1: Angiogenin chuột lang (2 µg) Giếng 2: Angiogenin ngựa (2 µg)2. Angiogenin hạn chế số lượng tế bào máu từ cuống rốn(HUVECs) bị chết theo chương trình (apoptosis)Những nghiên cứu trước đây cho thấy trong môi trường(EGM 2) nuôi cấy tế bào máu từ cuống rốn (HUVECs) nếukhông được bổ sung các nhân tố sinh trưởng thì sau 48 giờcác tế bào này sẽ chuyển sang giai đoạn chết theo chươngtrình (apoptosis) (2). Nghiên cứu trước đây của chúng tôicũng cho thấy angiogenin của chuột lang có khả năng kíchthích sự phân chia của tế bào máu (4). Do vậy, tác giả giảthuyết rằng angiogenin của ngựa có khả năng hạn chế cáctế bào máu chết theo chương trình. Để kiểm chứng giảthuyết này, kit Annexin V-FITC Apoptosis Detection đượcsủ dụng để phát hiện số lượng tế bào máu ở giai đoạn chếttheo chương trình trong trường hợp không hoặc có bổ xungangiogenin của ngựa vào môi trường nuôi cấy.Kết quả thí nghiệm cho thấy có 19,42% tế bào HUVEchuyển sang giai đoạn chết theo chương trình sau 48 giờnuôi cấy ở môi trường EGM 2 khi không bổ sung các nhântố sinh trưởng, so với 11,98% tế bào HUVE chuyển sanggiai đoạn chết theo chương trình khi có 1 µg/ml angiogenincủa ngựa trong môi trường môi cấy (Hình 2). Kết quả nàycho thấy, đúng như giả thuyết đặt ra, angiogenin có khảnăng hạn chế số lượng tế bào HUVE bị chết theo chươngtrình. Hình 2. Angiogenin hạn chế các tế bào HUVE chết theo chương trìnhA. Đối chứng âm (môi trường nuôi cấy không bổ xung các nhân tố tăng trưởng, chỉ có PBS) B. Angiogenin của ngựa (ANG -1 mg/ml) được bổ sung trong nuôi trường nuôi cấyC. Đồ thị so sánh số lượng tế bào chết theo chương trình sau khi bổ xung PBS và angiogenin3. Angiogenin kích thích sự hình thành mạch máu in vivoCAM (chorioallantoic membrane) là thí nhiệm được sửdụng rất phổ biến như một mô hình quan sát sự hình thànhvà kích thích mạch máu phát triển in vivo (6). Lần đầu tiênangiogenin của người được xác định tính chất cũng dựatrên khả năng kích thích hình thành các mạch máu mớitrong thí nghiệm CAM này (7). Sau đó, angiogenin của bò,lợn và thỏ đều được thông báo có tính chất tương tự nhưangiogenin của người ở thí nghiệm CAM (2). Để kiểm trakhả năng kích thích sự hình thành và phát triển của mạchmáu, angiogenin tái tổ hợp của ngựa sau tinh chế với cáclượng khác nhau (62,5 đến 250 ng) được đem thử nghiệmvới kỹ thuật CAM. Kết quả thí nghiệm cho thấy trong tổngsố 31 trứng gà có đặt 62,5 ng angiogenin thì 9 trứng ( hay29%) quan sá ...