BÁO CÁO KHOA HỌC: NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI GANODERMA BẰNG MỒI PCR ĐẶC HIỆU CHO GEN SUPEROXIDE DISMUTASE

Trong tự nhiên chi Ganoderma rất đa dạng và không phải tất cả các loài này đều sản sinh ra các hợp chất sinh học có tác dụng như nhau, nên việc phân loại chính xác chúng không phảI chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang tính thực tiễn.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI GANODERMA BẰNG MỒI PCR ĐẶC HIỆU CHO GEN SUPEROXIDE DISMUTASE"NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI GANODERMA BẰNGMỒI PCR ĐẶC HIỆU CHO GEN SUPEROXIDEDISMUTASENguyễn Hoài GiangViện Vệ sinh Dịch tễ Trung ươngNguyễn Xuân Hùng, Lê Đình LươngTrung tâm Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà nộiĐẶT VẤN ĐỀTrong tự nhiên chi Ganoderma rất đa dạng và không phảitất cả các loài này đều sản sinh ra các hợp chất sinh học cótác dụng như nhau, nên việc phân loại chính xác chúngkhông phảI chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang tính thựctiễn. Sự phân loại Ganoderma được thực hiện đầu tiên dựatrên màu sắc và hình thái, tiếp theo là phân loại bằng cácisozym, và gần đây là ở mức độ ADN (2, 3, 4). Trongnghiên cứu trước chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật RAPD vàPCR với mồi đặc hiệu cho gen laccase để phân loại một sốchi Ganoderma ở Việt nam (4). Từ những kết quả thu được,chúng tôi tiến hành nghiên cứu các chỉ thị phân tử mớinhằm phân loại Ganoderma chính xác và cụ thể hơn.Enzym superoxide dismutase (SODs) có vai trò quan trọngtrong cơ chế bảo vệ của tế bào. Gốc O2 - gây độc cho tế bàovà SODs xúc tác quá trình chuyển O2 - thành O2 và chuyểnO2 - và H - thành H2O2. SODs được phát hiện có tồn tạitrong các tế bào từ vi khuẩn đến thực vật và động vật bậccao (5). Đến nay người ta đã biết có 4 loại SODs, sự phânchia này dựa trên các nguyên tố kim loại có ở vị trí hoạtđộng của enzym này: Mn SOD, Fe SOD, Cu, Zn SOD vàNi SOD. Enzym Mn SOD giống nhau đến 65% giữa cácloài thực vật và chúng có độ tương đồng cao với vi khuẩn.Mỗi phân tử Mn SOD mang một nguyên tử mangan vàenzym này không hoạt động được nếu không có nguyên tửmangan ở vị trí hoạt động. So sánh trình tự axít amin củacác SODs cho thấy Mn SOD và Fe SOD có nguồn gốc cổhơn so với các loại SODs còn lại, và có nhiều khả năngchúng tiến hoá từ một loại enzym ban đầu. Ngược lại, Cu-Zn SODs lại không có trình tự tương tự với Mn SOD và FeSOD và có thể chúng tiến hoá riêng biệt trong quá trìnhphát triển của các tế bào nhân chuẩn (5, 6).Trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu phương pháp sửdụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen Mn SODđể phân loại và xếp nhóm cho Ganoderma ở Việt nam.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP1. Vật liệuCác mẫu nấm Ganoderma lucidum với các dưới loài khácnhau được ký hiệu là Gl 1 và Gl 2; Ganoderma australesensulato với các dưới loài khác nhau được ký hiệu là Ga 1và Ga 2; Ganoderma applanatum sensulato với các dướiloài khác nhau được ký hiệu là Gb 1 và Gb 2; Ganodermatortnatum sensulato với các dưới loài khác nhau được kýhiệu là Gc 1 và Gc 2; Ganoderma australe được ký hiệu làGau, do GS. Trịnh Tam Kiệt, phòng Giống nấm gốc, Trungtâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà nội cungcấp.2. Phương pháp nghiên cứu ADN được tách chiết từ các mẫu Ganoderma theo•Nguyễn Thị Kim Dung và Lê Đình Lương, có cải tiến, đểtăng số lượng ADN thu được (7). PCR với mồi đặc hiệu cho gen Mn SOD của•Ganoderma australe là FGau 1 và RGau 1. PCR với mồi đặc hiệu cho gen Mn SOD của•Ganoderma lucidum và Ganoderma australe là FGau 1 vàRGau 2. Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid 6% và•nhuộm bạc (8).KẾT QUẢ, THẢO LUẬN1. Thiết kế các cặp mồi của gen Mn SOD để phân loạiGanodermaTrong nghiên cứu trước (4) sử dụng kỹ thuật PCR với mồingẫu nhiên (OPU1: 5- ACGGACGTCA -3) và cặp mồiđặc hiệu laccase (LA1: 5- CAT TGG CAC GGA TTCTTC -3’ và LA2: 5- ATG GCT GTG GTA CCA GAA -3),các mẫu Ganoderma nghiên cứu đã được phân ra thành cácnhóm: (i) Ganoderma lucidum với sản phẩm PCR 217 bphoặc 144 bp của gen laccase, (ii) Ganoderma australe vàGanoderma tortnatum sensulato với sản phẩm PCR 144 bpcủa gen laccase và (iii) Ganoderma applanatum sensulatovà Ganoderma australe sensulato không tạo sản phẩm PCRvới cặp mồi LA 1 và LA 2.Trong nghiên cứu này, chúng tôi dùng gen mã hoá enzymMn SOD để phân loại cụ thể hơn các mẫu Ganoderma nêutrên. Khai thác dữ liệu từ Ngân hàng gen quốc tế(Genbank) và kết quả sử dụng phần mềm chuyên dụngBlast (www.ncbi.nlm.nih.gov) để so sánh trình tự gen MnSOD của Ganoderma lucidum (số hiệu U56134, Genbank)với trình tự gen Mn SOD của Ganoderma australe (số hiệuU56112, Genbank) cho thấy gen Mn SOD của hai loài nàycó độ tương đồng khá cao (các nucleotid giống hệt nhauđược thể hiện bằng các dấu *, Hình 1). Tuy nhiên, tronggen Mn SOD của Ganoderma lucidum và Ganodermaaustrale cũng có những đoạn trình tự khác biệt đặc trưngriêng cho từng loài (thể hiện bằng các khoảng trống hoặcdấu -, Hình 1). Sử dụng các đoạn có trình tự giống hệt nhaucủa hai loài Ganoderma này, chúng tôi thiết kế mồi xuôi(FGau 1) và mồi ngược (RGau 2) để nhân các đoạn tronggen Mn SOD. Ngoài ra, sử dụng đoạn trình tự khác biệt đặchiệu của Ganoderma australe, chúng tôi đã thiết kế mộtmồi ngược dành riêng cho loại Ganoderma này với ký hiệuRGau 1.Trình tự các mồi như sau:FGau 1: 5’-GAA GCA CCA CCA GAC CTA CGT G-3’RGau 1: 5’-ATC GA ...