BÁO CÁO KHOA HỌC: NGHIÊN CỨU TẠO MÔ SẸO PHÔI HOÁ VÀ PHÔI VÔ TÍNH TỪ NUÔI CẤY NOÃN Ở MỘT SỐ GIỐNG CÂY ĂN QUẢ CÓ

Hiện nay, nuôi cấy mô sẹo phôi hoá (ký hiệu EC embryogenic callus) là một kỹ thuật cơ bản trong tạo giống citrus. Callus phôi hoá đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau như tạo giống sạch bệnh, nghiên cứu phát sinh hình thái phôi vô tính, nhân sinh khối tế bào dịch lỏng, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể (Grosser et al, 2000), nghiên cứu chuyển gen và bảo quản nguồn gen (Kunitake and Mu, 1995)....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU TẠO MÔ SẸO PHÔI HOÁ VÀ PHÔI VÔ TÍNH TỪ NUÔI CẤY NOÃN Ở MỘT SỐ GIỐNG CÂY ĂN QUẢ CÓ "NGHIÊN CỨU TẠO MÔ SẸO PHÔI HOÁ VÀ PHÔIVÔ TÍNH TỪ NUÔI CẤY NOÃN Ở MỘT SỐ GIỐNGCÂY ĂN QUẢ CÓ MÚIHà Thị Thuý1, Trần Thị Hạnh1,Nguyễn Hồng Chiên1,Đỗ Năng Vịnh1, Vũ Văn Vụ21 Viện di truyền nông nghiệp, 2 Đại học Quốc gia Hà NộiI. Đặt vấn đề:Hiện nay, nuôi cấy mô sẹo phôi hoá (ký hiệu EC -embryogenic callus) là một kỹ thuật cơ bản trong tạo giốngcitrus. Callus phôi hoá đã được sử dụng trong nhiều nghiêncứu khác nhau như tạo giống sạch bệnh, nghiên cứu phátsinh hình thái phôi vô tính, nhân sinh khối tế bào dịch lỏng,nuôi cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể(Grosser et al, 2000), nghiên cứu chuyển gen và bảo quảnnguồn gen (Kunitake and Mu, 1995).Tái sinh cây từ mô sẹophôi hoá ở các giống cam, Grosser và cộng sự đã tạo ranhiều dạng đột biến ổn định, như chín sớm hoặc muộn hơn,không hạt, chất lượng được nâng cao (Grosser et al., 2000).Để tạo callus phôi hoá có nguồn gốc từ phôi tâm(Nucellar) in vitro ở citrus người ta có thể nuôi cấy noãnđã thụ tinh hoặc chưa thụ tinh. Callus phôi hoá còn đượctạo ra khi nuôi cấy các hạt lép của quả chín từ 8 đến 15tháng tuổi kể từ khi hoa tung phấn (Starrantino and Russo,1980). Ngoài ra callus phôi hoá đã được tạo ra từ nuôi cấymô hoặc cơ quan khác như từ bao phấn (Hidaka andOmura, 1989), từ chân nhuỵ cái (Style) ở chanh tây(Limon). Carimi và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy đầunhuỵ cái (Stigma) và chân nhị cái (Style) của nhiều giốngcitrus khác nhau để tạo callus phôi hoá và tái sinh cây(Carimi et al., 1995; De Pasquale et al. 1994). Kết quả chothấy các loài C.limon, C.medica và Cam ngọt cho kết quảtạo callus và tái sinh phôi tốt nhất.Mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là xây dựng quy trìnhtạo nguồn mô sẹo phôi hoá, từ đó tạo phôi vô tính và táisinh cây phục vụ cho nghiên cứu chọn tạo giống không hạtvà vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen trong tương lai.II. Nguyên liệu và phương pháp:a/ Nguyên liệu:Các giống cây ăn quả có múi địa phương và nhập nội khácnhau như: Bưởi Phúc Trạch (Citrus grandis), Cam Vân Du,Olinda Valencia, Navel, Cam Sành (C. nobilis), QuýtChum, Quýt Đường canh (C. reticulata) và quýt laiMurcott đã được sử dụng trong nghiên cứu.Mẫu nuôi cấy: noãn trước và sau thụ phấn ở các độ tuổikhác nhau (từ 1 đến 8 tuần tuổi). Cách làm như sau: Bầunhuỵ lấy nuôi cấy một ngày trước khi hoa nở. Sau khi hoađược thụ phấn, nhuỵ cái rụng, bầu nhuỵ phát triển thànhquả non. Quả non của các giống trên được thu hái ở 1, 2, 3,đến 8 tuần tuổi kể từ sau khi hoa tung phấn. Từ bầu nhuỵcái và quả non đã được khử trùng, tách lấy noãn (noãn sauthụ phấn phát triển thành hạt non) để nuôi cấy trên các môitrường khác nhau.Noãn được nuôi cấy trên đĩa Petri, mỗi đĩa chứa 16 noãn.Mỗi lô thí nghiệm với 60 quả hoặc bầu nhuỵ. Riêng với quảnon có độ tuổi 6, 7, 8 tuần, chúng tôi tiến hành tách bỏ vỏlụa ở bên ngoài của hạt non, sau đó tách loại bỏ phôi nonrồi mới cấy vào đĩa môi trường. Tất cả các thao tác trênđược thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi.b/ Môi trường và điều kiện nuôi cấy nuôi cấy:Theo kết quả nghiên cứu nuôi cấy bầu nhuỵ và noãn ở quảnon của một số giống citrus thì môi trường MT (Murashige& Tucker) là môi trường thích hợp nhất cho tạo callus phôihoá (Đỗ Năng Vịnh, 2002). Vì vậy chúng tôi tiến hành thínghiệm nuôi cấy noãn và hạt non trên nền môi trường này.+Môi trường tạo callus phôi hoá:- MT + các nồng độ khác nhau của Kinetine: 0,25; 0,5;0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 ( mg/l) + 500mg/l Maltextract + 50g/l đường + 5,0g/l thạch.- MT + các nồng độ khác nhau của BAP: 0,25; 0,5; 0,75;1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 (mg/l) + 500mg/l Malt extract +50g/l đường + 5,0g/l thạch.+ Môi trường lỏng lắc nhân sinh khối callus phôi hoá: MT+ BAP (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) + 30g/l đường + 500mg/lMalt extract + 1,0g/l glutamin+ Môi trường tạo phôi: G1: MT + 1,0mg/l GA3 + 30g/l đường + 5,0g/l thạch• G2: MT + 1,5mg/l GA3 + 30g/l đường + 5,0g/l thạch• BG: MT + 1,0mg/l GA3 + 0,2mg/l BAP + 5,0g/l thạch•+ Môi trường nẩy mầm phôi vô tính: MS hoặc MT + 30g/lđường, không có chất điều hoà sinh trưởng.Môi trường được chỉnh đến pH= 5,8. Noãn được nuôi trênđĩa petri (15mm dày x 60mm đường kính) chứa 12 ml môitrường thạch, để trong tối.Nhân mô sẹo phôi hoá: mô sẹo được nhân trên môi trườngđặc (thời gian 1tháng), sau đó chuyển sang môi trường lỏng( 2 tuần ) rồi lại nhân tiếp trên môi trường đặc. Nhân môsẹo trong tối ở nhiệt độ (25 - 27oC). Quá trình phôi hoá củamô sẹo và nảy mầm của phôi xảy ra trong điều kiện cóchiếu sáng 2400 Lx và thời gian chiếu sáng là 8 h/ngày.III. Kết quả và thảo luận1.Tạo vật liệu nuôi cấy vô trùngĐể tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng, chúng tôi tiến hành khửtrùng quả non với hai loại hoá chất Ca(ClO)2 ở nồng độ 6%và HgCl2 ở nồng độ 0,01%. Kết quả cho thấy với các chấtkhử trùng khác nhau và trong khoản ...