BÁO CÁO KHOA HỌC: PHÂN LẬP CÁC CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI Ở VIỆT NAM

Ngày nay các chế phẩm sinh học an toàn cho phòng trừ sâu hại cây trồng và nông sản bảo quản đã được khuyến khích, ứng dụng để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá học, trong đó thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis (gọi tắt là Bt) được dùng rộng rãi nhất.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÂN LẬP CÁC CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI Ở VIỆT NAM"PHÂN LẬP CÁC CHỦNG BACILLUSTHURINGIENSIS KURSTAKI Ở VIỆT NAMBùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn,Nguyễn Thuỳ ChâuBộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu hoạchĐinh Duy KhángPhòng Vi Sinh Phân tử, Viện Công Nghệ Sinh họcNgày nay các chế phẩm sinh học an toàn cho phòng trừ sâuhại cây trồng và nông sản bảo quản đã được khuyến khích,ứng dụng để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá học, trongđó thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis (gọi tắt làBt) được dùng rộng rãi nhất. Trong những năm gần đây cácnhà khoa học đã có rất nhiều cố gắng để phân lập vi khuẩnnày từ môi trường của nhiều nước trên thế giới với hy vọngtìm ra những chủng B. thuringiensis có phổ gây bệnh mớivà khoảng vật chủ rộng hoặc nâng cao hoạt tính các chủngB.thuringiensis đối với các nhóm côn trùng mới, hay tìmkiếm nguồn gen từ những chủng phân lập cho các kỹ thuậtdi truyền tiếp theo. Với sự phát triển mạnh mẽ của côngnghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là công nghệ gen đã mở ranhững tiềm năng hết sức to lớn cho việc phát triển thuốc trừsâu sinh học B. thuringiensis. Việc làm giàu thêm bộ sưutập các chủng B. thuringiensis phân lập ở Việt Nam vànguồn gen quý từ những chủng này nhằm tạo ra các chủngtái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng hơn đối với một số loàicôn trùng quan trọng là rất cần thiết. Chúng tôi đã tiến hànhphân lập, phân loại các chủng B. thuringiensis có hoạt tínhdiệt sâu từ nguồn tự nhiên của Việt Nam, sử dụng một sốkỹ thuật sinh hoá và sinh học phân tử để xác định tính chấtcủa các chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập được.I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:I.1. Thu thập mẫu để phân lập các chủng B. thuringiensisTiến hành thu thập 137 mẫu gồm có 55 mẫu đất nôngnghiệp, 56 mẫu lá, 26 mẫu mùn thóc từ các nguồn khácnhau của một số tỉnh có sinh thái khác nhau ở miền BắcViệt nam.I.2. Phân lập các chủng B. thuringiensis:Cắt một phần của lá (2-3 cm2) nghiền với 0,5 ml dịch nướcmuối. Đối với các mẫu đất và mùn thóc cân 0,5 gam trộnvới 5 ml môi trường T3 lỏng chứa 0,25 M đệm natri acetate(pH = 6,8) và lắc trong 4 giờ ở 150 vòng/phút, nhiệt độ 300 C. Mẫu được xử lý nhiệt ở 800C trong 3 phút. Lấy 0,2 mldịch nổi trải trên đĩa petri có môi trường T3 nuôi ở 30 0Ctrong 3 ngày. Quan sát hình dạng tinh thể của các chủng B.thuringiensis phân lập bằng kính hiển vi đối pha Olympus.I.3. Thử sinh học hoạt tính diệt sâu:Tiến hành theo phương pháp của S.H.Park [10]: Đối tượngsâu được thử là sâu tơ (Plutella xylostella), sâu keo(Spodoptera exiqua) và sâu khoang (Spodoptera litura): lábắp cải tươi được cắt thành các khoanh tròn có đường kính3cm vào hỗn dịch bào tử tinh thể B. thuringiensis có nồngđộ 5x107 bào tử/ml, sau đó đặt vào đĩa petri và cho vàomỗi đĩa 10 con sâu; mỗi mẫu thử với 30 con sâu. Đối vớisâu bông (Helicoverpa armigera) cũng được tiến hànhtương tự trên lá bông. Hoạt tính diệt sâu ngài gạo (Corrcyracephalonia) được đánh giá như sau: bỏ 30 con sâu ngài gạovào bình thuỷ tinh 400g gạo đã được nhiễm bào tử và tinhthể của B. thuringiensis với liều 5x107 bào tử/gam gạo, nuôiở 300C với độ ẩm 70-80%.I.4. Xác định tính chất 10 chủng B. thuringiensis kurstakiphân lập.Điện di protein (SDS-PAGE) bào tử và tinh thể của cácchủng B. thuringiensis.Chủng B. thuringiensis phát triển trên môi trường thạch T3đã được tạo hỗn dịch trong 5 ml dịch 0,02% Triton X-100.Ly tâm trong 1 phút. Cặn được hoà tan với 30 l đệm SDS(1x SDS gel- loading buffer). Các mẫu được đun sôi trong5 phút, ly tâm ở 8000vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổivà chạy điện di trên gel polyacryamide 10% ở 30 mA theophương pháp của Sambrook và Maniatis.I.5. Phát hiện gen cry1Ab, cry1C bằng kỹ thuật PCR.Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựngtrong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khửion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l, primer 2l, enzimTag-polymeraza 0,4l, MgCl2: 2l, ADN 2l ( nồng độ50ng/l).Sử dụng cặp mồi TY6(5’-GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) vàTY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’); TYIC(5’-CAAC CT CTAT TT G GTGCAGGTTC-3’) vàTYIUNI (5’-ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTT CTC-3’)theo thứ tự, để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gencry1Ab và cry1C. Các sản phẩm PCR được phân tích bằngđiện di trên gel agaroza 1%.II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN:II.1. Phân lập các chủng B. thuringiensisTrong số 137 mẫu từ các nguồn khác nhau gồm: 55 mẫuđất, 56 mẫu lá, 26 mẫu mùn thóc, đã phân lập được 36chủng B. thuringiensis. Số chủng tinh thể có hình quả trámlà 11(chiếm 31%), số chủng có tinh thể hình khối lậpphương là 10 (chiếm 28%), số chủng tinh thể có hìnhvuông và hình chữ nhật là 6 (chiếm 17%), số chủng có tinhthể không đều đặn là 4 (chiếm 10%) số chủng có tinh thểhình cầu là 2 (chiếm 5%) và chủng có thể vùi nhỏ là 3(chiếm 8%). Tần suất B. thuringiensis phân bố cao nhất từnguồn đất là 35%, trên mùn thóc là 30% và thấp nhất ở trênlá ...