BÁO CÁO KHOA HỌC: PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM

Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở Việt Nam. Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vững sinh thái ở Việt nam đã được thiết lập. Để góp phần thực hiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồng bằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong những năm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM"PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢNĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUMTRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDGEN 16S-ARN RIBOSOMNguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, LêThanh Hòa, Nguyễn Ngọc DũngViện Công nghệ Sinh học.Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở ViệtNam. Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vữngsinh thái ở Việt nam đã được thiết lập. Để góp phần thựchiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồngbằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong nhữngnăm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000). Một trongnhững nhóm vi khuẩn hữu ích cho cây lúa cần được khaithác là vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang bởi chúngđược coi là tác nhân sinh học tiềm năng trong phòng chốngvi nấm gây bệnh cây trồng (O,Sullivan và cộng sự, 1992,Berg và cộng sự, 2000). Các chủng pseudomonad sinhhuỳnh quang vùng rễ cây lúa đã được phân lập và chọn lọctheo khả năng đối kháng Fusarium oxysporum, tác nhângây bệnh khô vằn cây lúa (Nguyễn Thị Tuyết Nhung vàcộng sự, đang in). Do có những đặc điểm riêng hình thành trong suốt qúatrình tiến hoá nên các gen sao mã các axit ARN ribosom(ARNr) ở vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt các gen 16S- và 23S-ARNr, được sử dụng như một công cụ trong việc phânloại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng vikhuẩn ( Woese, 1987). Theo Ludwig và Schleifer ( 2000)đã có tới hơn 16000 gen 16S-ARNr từ các chủng vi khuẩnđã được xác định trình tự nucleotid. Trong bài báo này, vị trí phân loại của chủng Ps7-1 sẽđược trình bày trên cơ sở phân tích trình tự nucleotid gen16S-ARN ribosom (16S-ARNr).I. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP1. Vi sinh vật: Chủng phân lập Ps7-1 có nguồn gốc từ đất bám rễ câylúa ở Kim Chung, Đông Anh, Hà Nội và cho khả năng đốikháng F. oxysporium cao trong điều kiện in vitro (NguyễnThị Tuyết Nhung và cộng sự, đang in) và chủng E. coliDH5 đã được sử dụng.2. Các phương pháp phân loại:a. Phương pháp phân loại theo kiểu hình: Phương pháp phân loại vi khuẩn được chuẩn hoá API20NE (BioMerieux Marcy, Pháp) đã được sử dụng. Theonhà cung cấp, hệ thống API 20NE chỉ dùng để phân loạicác nhóm vi khuẩn hình que, Gram âm, không thuộc HọEnterobactieraceae. Ngoài các đặc tính theo API 20NE,các đặc điểm kỵ khí không bắt buộc và kháng tetraxyclinđã được xác định. Đặc điểm kỵ khí không bắt buộc đượctiến hành theo phương pháp cấy thẳng đứng vào môitrường LB rắn có chiều cao 10 cm trong ống nghiệm; mẫuđược ủ ở 30oC và đọc kết quả sinh trưởng sau 24 và 48 giờủ. Tính mẫn cảm đối với tetraxyclin (30g/ml) được tiếnhành theo phương pháp Krieg và Doebereiner (1984). Theođó, tế bào Ps7-1 nuôi qua đêm được ria trên môi trường LBrắn, sau đó đặt đĩa giấy ( : 5 mm) thấm đậm dung dịchtetraxyclin lên trên. Chủng E. coli DH5 được sử dụng làmđối chứng. Quan sát sinh trưởng của vi khuẩn xung quanhđĩa giấy thấm sau 24 giờ ủ.b. Phương pháp phân loại theo kiểu gen: -Thu ADN tổng số:ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp Mastersonvà cộng sự (1985). -Thu nhận gen 16S-ARNr: Gen 16S-ARNr được thu nhận bằng phản ứng nhân bảngen (PCR) với cặp mồi có trình tự như sau. Mồi thuậnchiều Prf: 5,-GAGTTTGATCATGGCTAA-3,., tương ứngvới các vị trí nucleotid 7-26 của gen 16S-ARNr từ E. coli;mồi nghịch chiều Prr: 5,- AGGAGGTGATCCAGCC-3,,tương ứng với các vị trí 1540-1524 từ E. coli, do Genset-Oligos Singapore, cung cấp. Hỗn hợp phản ứng nhân bảngen có thể tích 25 l với thành phần: 16,7 l nước sạch ion,2,5 l đệm Taq(10x), 2,5 l dung dịch dNTP (10mM), 1,0l dịch mồi Prf (10mM), 1,0 l dịch mồi Prr (10mM), 1,0l dịch ADN khuôn và 0,3 l Taq Polymerase. Phản ứngđược thực hiện với chu trình nhiệt như sau: Giai đoạn đầu,ADN được biến tính ở 95o C trong 1 phút 30 giây, tiếp tụcbiến tính ở 940 C trong 1 phút, kế tiếp mồi được gắn ở nhiệtđộ 520 C và phản ứng kéo dài chuỗi ở 720 C trong 1 phút 20giây. Giai đoạn chính được lặp lại 30 lần chu kỳ nhiệt cơbản giống ở giai đoạn đầu, chỉ khác ở chỗ ADN được biếntính một lần ngay ở nhiệt độ 940 C trong 1 phút, tiếp saupha cuối cùng phản ứng kéo dài chuỗi được duy trì ở 72 0 Ctrong 10 phút và sản phẩm được bảo quản ở 40 C. Kết quảphản ứng được kiểm tra bằng điện di agarose 0,8%. Sảnphẩm nhân bản gen được gắn vào vectơ pCR2.1 theo chỉdẫn của nhà cung cấp TA Cloning Kit, Invitrogen. VectơpCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR được chuyển nạp vàodòng tế bào INVaF’ và chọn lọc khuẩn lạc theo phươngpháp kháng sinh và chỉ thị màu (SAMBROOK vàRUSSELL, 2001). ADN plasmid tái tổ hợp được tách chiếtvới bộ hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit(QIAGEN Inc.). Độ dài sản phẩm dòng hoá được kiểm tratrên thạch agarose 0.8%, sau khi cắt ADN của plasmid táitổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI.3. Giải trình trình tự chuỗi nucleotit và xử lý số liệu:Chuỗi ADN chứa gen 16 ...