BÁO CÁO KHOA HỌC: PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Virut gây bệnh đầu vàng (YHV-Yellow Head Virus), tìm thấy đầu tiên tại Thái Lan vào đầu những năm 1990, có vật chất di truyền là ARN. Đây là một trong những tác nhân chính gây bệnh đầu vàng ở tôm cùng với một số virut tương cận như GAV (Gill-Associated Virus) và LOV (Lymphoid Organ Virus).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR"PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊNTÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCRPhan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạm AnhTuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thuỳ DươngKhoa Sinh học - Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên -ĐHQG Tp HCMViện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản IViện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản IITỔNG QUANVirut gây bệnh đầu vàng (YHV-Yellow Head Virus), tìmthấy đầu tiên tại Thái Lan vào đầu những năm 1990, có vậtchất di truyền là ARN. Đây là một trong những tác nhânchính gây bệnh đầu vàng ở tôm cùng với một số viruttương cận như GAV (Gill-Associated Virus) và LOV(Lymphoid Organ Virus). YHV tác động trên tôm chủ yếuở giai đoạn tôm con đến tôm gần trưởng thành. Tôm bệnhsẽ chết hàng loạt sau 2 - 4 ngày, với sự xuất hiện màu vàngở phần đầu ngực và sự nhạt màu của toàn cơ thể. Các quansát mô bệnh học cho thấy tình trạng hoại tử của những tếbào có nguồn gốc ngoại phôi bì và trung phôi bì cùng vớisự hình thành những thể vùi ưa kiềm trong tế bào chất.Với khả năng lây nhiễm và gây chết nhanh, bệnh gây ảnhhưởng không nhỏ đến nền kinh tế của những quốc gia cónghề nuôi tôm phát triển. Do chưa có thuốc chữa trị đặchiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rấtcần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như môbệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi khôngcho phép phát hiện sớm và đặc hiệu tác nhân gây bệnh.Nhiều phương pháp phân tử như lai tại chỗ, Western blot,RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhượcđiểm vừa kể trong việc phát hiện YHV trên tôm sú.Chúng tôi thiết lập quy trình RT-PCR trên ARN YHV đồngthời xác định tính đặc hiệu và độ nhạy của quy trình. Quytrình sau đó được áp dụng để phát hiện YHV trong 20 mẫutôm sú nghi nhiễm.VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁPMẫu tôm: Các mẫu tôm nghi nhiễm YHV và ARN YHV doViện NCNT Thuỷ Sản II cung cấp. Các mẫu này được bảoquản trong cồn tuyệt đối và giữ ở -200C.Phương pháp tách chiết ARN (TriZol): Mẫu tôm đượcnghiền trong dung dịch TriZol (guanidinium thiocyanate,phenol pH8, glycerol, sodium acetate). 200 l dịch nghiềnđược ly giải và loại protein tiếp tục bằng dung dịch TriZol.Sau đó ARN được tủa bằng isopropanol. Sau ly tâm, cặnđược làm khô và hòa lại trong 50 l H2O đã xử lý DEPC(Diethyl pyrocarbonate)Đoạn mồi cho phản ứng RT-PCR: Chúng tôi sử dụng cácphần mềm Annhyb và ClustalX để thiết kế các đoạn mồidùng cho phản ứng RT-PCR dựa trên các trình tự hệ genYHV được công bố (Tang & Lightner, 1999). Các đoạnmồi này gồm đoạn mồi xuôi YHVf và các đoạn mồi ngượcYHVr và YHVi với trình tự như sau : YHVf 5-GTGACCATYTYAACTGCAAGATCTCACGRCAACTCA-3,YHVr 5-CTGCYACTGAATTTCCGACGAGAGTGTTAGGAGG-3, YHVi 5-GTCTCACACACATGGACTTC-3.đoạn mồi do hãng GENSET OLIGO (Singapore) tổng hợpvà cung cấp.Phương pháp RT-PCR : bao gồm hai bước RT và PCR.Trong bước RT, phản ứng được thiết lập với1 hạt bead RT-PCR (Amersham), 1 l đoạn mồi YHVr, 19 l ARN, ủ ở420C-45 phút. Để tiến hành phản ứng PCR, cho thêm vàohỗn hợp RT 2 l đoạn mồi YHVf, 1.5 l đoạn mồi YHVivà nước vừa đủ 50 l. Chương trình PCR : 950C-3; 15 chukỳ 940C-30, 620C-30, 720C-30; 36 chu kỳ 940C-30,480C-30, 720C-30; 720C-6.Phương pháp Southern Blot : Các sản phẩm PCR sau điệndi và biến tính được chuyển lên màng lai nylon (HybondN+ - Amersham) và tiến hành lai với mẫu dò là trình tựđoạn mồi YHVi được đánh dấu bằng DIG - dUTP. Bộ kitDIG Nucleic Acid Detection (Boehringer Mannheim) đượcsử dụng để phát hiện các phân tử lai.KẾT QUẢ - THẢO LUẬNKết quả thiết kế đoạn mồi và chương trình PCR tương ứng:Các đoạn mồi thiết kế cho phản ứng RT và PCR dùng đểnhân bản một trình tự trên ARN hệ gen của YHV có vị tríbắt cặp dự kiến theo sơ đồ sau (hình 1). Hình 1 : Sơ đồ bắt cặp các đoạn mồi và sản phẩm PCR từ ARN hệ gen YHVChúng tôi kiểm tra hiệu quả nhân bản của các cặp đoạn mồithiết kế cũng như các chương trình PCR tương ứng trênARN YHV có (hình 3) và không có (hình 2) kết hợp vớidịch chiết tôm. Kỹ thuật PCR sử dụng ở đây là kỹ thuậtPCR semi-nested, gồm hai bước : (1) PCRI cho phép nhânbản đoạn ADN có kích thước 303 bp, (2) PCRII nhân bảnđoạn ADN có kích thước 186 bp từ sản phẩm PCRI.Hình 2 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm PCRI và II từ RNA YHV. 1,2 : Sản phẩm PCRI (303 bp); 3 : Thang X 174 Hae-III; 4,5 : Sản phẩm PCRII (186 bp).Hình 3 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm PCRII từ RNA YHV trộn với dịch chiết tôm 1 : Thang 186 bp 2, 3, 4, 5 : 1 l, 5 l, 10 l, 15l RNA YHV trộn với dịch chiết tômCác kết quả trên cho thấy tín hiệu dương tính nhận được cócường độ cao, với kích thước như dự kiến ; đồng thờikhông thấy sản phẩm ký sinh. Phản ứng tiến hành trên dịchchiết tôm kết hợp với ARN YHV cũng cho kết quả dươngtính rõ và có cường độ tương ứng với hàm lượng ARNtrong mẫu. Điều này cho thấy đoạn mồi và chương trìnhPCR hoạt động tốt.Tính đặc hiệu của sản phẩm PCR : Chúng tôi sử dụng mẫudò đặc hiệu cho YHV để kiểm tra tính đặc hiệu của các sảnphẩm PCR nhận được. Phản ứng Southern blot được tiếnhành trên các sản phẩm PCR khác nhau, được nhân bản từADN MBV (Monodon Baculovirus), ARN YHV và ADNWSSV (White Spot Syndrome Virus).Hình 4 A, B : Kết quả điện di và Southern blot với mẫu dò đặc hiệu cho YHV 1,2 : Sản phẩm PCR từ MBV; 3,4 : Sản phẩm PCRI từ YHV; 5: Thang X174- HaeIII; 6,7: Sản phẩm PCRII từ YHV; 8,9: Sản phẩm PCR từ WSSV.Kết quả (hình 4 A và B) cho thấy tín hiệu lai là hoàn toànđặc hiệu cho các mẫu YHV.Độ nhạy của quy trình RT-PCR : Độ nhạy của quy trìnhđược xác định bằng cách tiến hành phản ứng RT-PCR trênARN YHV (30 g/l) pha loãng nhiều bậc.Hình 5 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm PCR từ RNA YHV pha loãng6: Thang 100 bp; 1, 2, 3, 4, ...