BÁO CÁO KHOA HỌC: TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN ADN ĐẶC HIỆU THUỘC GEN CRY1AB TỪ MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Trong những năm gần đây thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis gọi tắt là (Bt) đã được ứng dụng an toàn và có hiệu quả để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá học. B. thuringiensis là vi khuẩn gram dương, mang các gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có hiệu quả diệt đối với nhiều loài côn trùng thuộc các bộ cánh vảy, cánh cứng và hai cánh.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN ADN ĐẶC HIỆU THUỘC GEN CRY1AB TỪ MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM"TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN ADNĐẶC HIỆU THUỘC GEN CRY1AB TỪ MỘT SỐCHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKIPHÂN LẬP Ở VIỆT NAMBùi Thị Hương, Nguyễn Thuỳ ChâuBộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu hoạch.Đinh Duy KhángPhòng Vi Sinh Phân tử, Viện Công Nghệ Sinh học, TrungTâm Khoa học Tự nhiên và Công Nghệ Quốc gia.Trong những năm gần đây thuốc trừ sâu vi sinh Bacillusthuringiensis gọi tắt là (Bt) đã được ứng dụng an toàn và cóhiệu quả để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá học. B.thuringiensis là vi khuẩn gram dương, mang các gen crysinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có hiệu quảdiệt đối với nhiều loài côn trùng thuộc các bộ cánh vảy,cánh cứng và hai cánh. Các nhà khoa học đã có rất nhiều cốgắng để phân lập vi khuẩn này và thu được nhiều bộ sưutập các chủng B. thuringiensis rất phong phú. Số các chủngB. thuringiensis phân lập thì nhiều nhưng mỗi chủng chỉchứa một số nhóm gen cry gây độc với một số loài côntrùng nhất định. Để sàng lọc các chủng B. thuringiensis cóchứa gen cry mong muốn, tạo dòng và xác định trình tự genđộc tố đó là vấn đề rất cần thiết, nó làm cơ sở cho cácnghiên cứu đi sâu tiếp theo đối với những gen cry này như:nhằm tạo ra các chủng B. thuringiensis tái tổ hợp mới cóphổ diệt sâu rộng, hoạt lực diệt sâu cao hơn đối với nhiềuloài côn trùng quan trọng; việc biến nạp các gen độc tố crythích hợp vào từng loại cây trồng để bảo vệ chúng trước sựtấn công của côn trùng. Chúng tôi đã tiến hành thăm dò sựtồn tại gen cry1Ab của một số chủng B. thuringiensis var.kurstaki phân lập ở Việt Nam, tạo dòng và xác định trình tựđoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry 1Ab đó và so sánh vớitrình tự cùng đoạn gen này đã được công bố trong Ngânhàng dữ liệu gen Quốc tế.I.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:I.1. Tách chiết ADN tổng số:Tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Maniatis[10]: các chủng B. thuringiensis được lên men lắc trên môitrường LB ở 370C qua đêm. Ly tâm ở 6.000v /phút, thu cặntế bào. Bổ sung 567l TE(10:1), 30l SDS 10%, 3lproteinaza K, ủ ở 370C trong 1 giờ. Bổ sung 180 l NaCl5M, ủ ở 650C trong 10 phút. Bổ sung 800l chloroform, lytâm ở 10000v/10phút, thu 600 l dịch nổi, bổ sung 300lchloroform và 300l phenol, trộn đều rồi ly tâm10.000v/10phút, thu 600l dịch nổi. Bổ sung 600lchloroform để loại phenol, ly tâm 10000v/10phút, thu400l dịch nổi. Bổ sung 40l NaOAC và 1ml cồn 100%, ủở - 200C sau 4 giờ, ly tâm 14000v/20phút, thu cặn ADN.Rửa lại với 1ml cồn 70% tiếp tục thu cặn bằng ly tâm14000v/20phút. Sấy khô cặn trong tủ cấy vô trùng, loạiRNaza bằng cách bổ sung 20lTE-RNaza và ủ ở 370C/ 1giờ.Nồng độ ADN được xác định bằng phương pháp đo độ hấpphụ ở bước sóng 260 nm (A260) và được tính bằng biểuthức:A260 x 50 x hệ số pha loãng = g ADN/mlSau khi xác định nồng độ, ADN được kiểm tra bằng điện ditrên gel agarose 1%.I.2. Nhân bản đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab bằngkỹ thuật PCRPhản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựngtrong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khửion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l, primer 2l, enzimTag-polymeraza 0,4l, MgCl2: 2l, ADN 2l ( nồng độ50ng/l).Sử dụng cặp mồi TY6(5’-GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) vàTY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’) đểnhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gen cry1Ab. Cácsản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose1%I.3. Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab.Tạo vectơ tái tổ hợp: tiến hành theo phương pháp củaSambrook và cs [10]: gắn trực tiếp sản phẩm PCR được tạora ở mục I.2 vào vectơ tách dòng PCRTM 2.1. Phản ứnggắn gồm: nước khử ion: 3l; Dung dịch đệm gắn: 1l; Sảnphẩm PCR:3l; vectơ PCRTM2.1: 2l; T4- ligaza: 1l. Ủqua đêm ở nhiệt độ 140C. Sau đó biến nạp sản phẩm gắnvào vi khuẩn E. coli chủng DH5. Các khuẩn lạc E. colichứa vectơ pCRTM 2.1 tái tổ hợp được chọn lọc trên môitrường LB chứa ampixillin, IPTG (Isopropyl- -D-Thiogalactopyranoside) và X-gal. Sau đó tách chiết ADNplasmid từ tế bào vi khuẩn bằng cách xử lý với dung dịchchứa NaOH, SDS để phá vỡ tế bào. Thu dịch nổi chứaADN plasmid, kết tủa bằng cồn rồi hoà lại cặn trong dungdịch đệm TE, ARN được loại bằng RNaza nồng độ100g/ml.I.4. Phân tích trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gencry1Ab.Sau khi tách chiết và tinh sạch vectơ tái tổ hợp từ tế bàochủ, gen được xác định trình tự theo phương pháp enzimhọc của Sanger nhờ bộ kit của Hãng Amersham-PharmaciaBiotech với máy xác định trình tự ADN tự động ALF-Express của Hãng Pharmacia. Phân tích kết quả được tiếnhành với chương trình PC/Gene.II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN:Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu 10 chủng B.thuringiensis var. kurstaki phân lập ở Việt Nam nhận đượctừ bộ sưu tập chủng giống B. thuringiensis của Bộ môn Visinh, Viện Công Nghệ Sau Thu Hoạch. Các chủng B.thuringiensis này đã được ...