BÁO CÁO KHOA HỌC: XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HOÁ SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS VAR. AIZAWAI H1 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Bacillus thuringiensis (gọi tắt là Bt) là vi khuẩn gram dương được phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, chúng chứa các gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có khả năng diệt nhiều loại côn trùng, vì thế chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh Bt đã được sử dụng để phòng trừ các côn trùng dịch hại thuộc các bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh cứng và các động vật không xương sống khác....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HOÁ SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS VAR. AIZAWAI H1 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM"XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HOÁ SINH VÀSINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG BACILLUSTHURINGIENSIS VAR. AIZAWAI H1 PHÂN LẬP ỞVIỆT NAMBùi Thị Hương, Nguyễn Thuỳ ChâuBộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu HoạchĐinh Duy KhángPhòng Vi Sinh phân tử, Viện Công Nghệ Sinh HọcBacillus thuringiensis (gọi tắt là Bt) là vi khuẩn gramdương được phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, chúng chứacác gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tốcó khả năng diệt nhiều loại côn trùng, vì thế chế phẩmthuốc trừ sâu vi sinh Bt đã được sử dụng để phòng trừ cáccôn trùng dịch hại thuộc các bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộcánh cứng và các động vật không xương sống khác. Trongnhững năm gần đây các nhà khoa học đã tập trung nghiêncứu, sưu tập, phân tích và sàng lọc các chủng B.thuringiensis thu nhận được ở các mẫu phân lập từ môitrường, với mục đích tìm ra những chủng mới có hoạt tínhdiệt sâu cao, phổ diệt sâu rộng đối với nhiều loài côn trùng.Việc xác định sự tồn tại các nguồn gen quý từ những chủngnày là công việc rất cần thiết, làm cơ sở tiền đề cho cácnghiên cứu đi sâu tiếp theo đối với những gen cry này như:việc gây đột biến vị trí có định hướng đối với gen cry nhằmtạo chủng B. thuringiensis mới chống khả năng khángthuốc của các loại côn trùng; việc tạo ra các chủng B.thuringiensis tái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng, hoạt lựcdiệt sâu cao hơn đối với nhiều loài côn trùng quan trọng;việc biến nạp các gen độc tố cry thích hợp vào từng loạicây trồng để bảo vệ chúng trước sự tấn công của côntrùng... Trong khuôn khổ bài báo này chúng tôi đã tiếnhành thử hoạt tính diệt sâu, thăm dò sự tồn tại gen cry1C vàcry1Ab của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phânlập ở Việt Nam. Tiến hành tạo dòng và đọc trình tự đoạnADN đặc hiệu thuộc gen cry 1C đồng thời so sánh với trìnhtự cùng đoạn gen này đã được công bố trong Ngân hàng dữliệu gen Quốc tế.I.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUI.1.Thử sinh học hoạt tính diệt sâu:Tiến hành theo phương pháp của S.H.Park: Đối tượng sâuđược thử là sâu tơ (Plutella xylostella), sâu keo(Spodoptera exiqua) và sâu khoang (Spodoptera litura): lábắp cải tươi được cắt thành các khoanh tròn có đường kính3cm vào hỗn dịch bào tử tinh thể B. thuringiensis có nồngđộ 5x107 bào tử/ml, sau đó đặt vào đĩa petri và cho vàomỗi đĩa 10 con sâu; mỗi mẫu thử với 30 con sâu. Đối vớisâu bông ( Helicoverpa armigera) cũng được tiến hànhtương tự trên lá bông. Hoạt tính diệt sâu ngài gạo (Corrcyracephalonia) được đánh giá như sau: bỏ 30 con sâu ngài gạovào bình thuỷ tinh 400g gạo đã được nhiễm bào tử và tinhthể của B. thuringiensis với liều 5x107 bào tử/gam gạo,nuôi ở 300C với độ ẩm 70-80%.I.2. Điện di protein (SDS-PAGE) bào tử và tinh thể củachủng B. thuringiensis var. aizawai H1Chủng B. thuringiensis phát triển trên môi trường thạch T3đã được tạo hỗn dịch trong 5 ml dịch 0,02% Triton X-100.Ly tâm trong 1 phút. Cắn được hoà tan với 30 l đệm SDS(1x SDS gel- loading buffer). Các mẫu được đun sôi trong5 phút, ly tâm ở 8000vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổivà chạy điện di trên gel polyacryamide 10% ở 30mA theophương pháp của Sambrook và Maniatis [5].I.3. Xác định sự tồn tại gen cry1Ab, cry1C bằng kỹ thuậtPCR.Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựngtrong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khửion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l, primer 2l, enzimTag-polymeraza 0,4l, MgCl2: 2l, ADN 2l ( nồng độ50ng/l).Sử dụng cặp mồi TY6(5’-GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) vàTY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’); TYIC(5’-CAACCTCTATTTGGTGC AGGTTC-3’) và TYIUNI(5’-ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC-3’) theo thứ tự, để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm tronggen cry1Ab và cry1C. Các sản phẩm PCR được phân tíchbằng điện di trên gel agaroza 1%.I.4. Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1C.Tạo vectơ tái tổ hợp: tiến hành theo phương pháp củaSambrook và cs [5]: gắn trực tiếp sản phẩm PCR được tạora ở mục I.3 vào vectơ tách dòng PCRTM 2.1. Phản ứng gắngồm: nước khử ion: 3l; Dung dịch đệm gắn: 1l; Sảnphẩm PCR:3l; vectơ PCRTM2.1: 2l; T4- ligaza: 1l. Ủqua đêm ở nhiệt độ 140C. Sau đó biến nạp sản phẩm gắnvào vi khuẩn E. coli chủng DH5. Các khuẩn lạc E. colichứa vectơ pCRTM 2.1 tái tổ hợp được chọn lọc trên môitrường LB chứa ampixillin, IPTG (Isopropyl- -D-Thiogalactopyranoside) và X-gal. Sau đó tách chiết ADNplasmit từ tế bào vi khuẩn bằng cách xử lý với dung dịchchứa NaOH, SDS để phá vỡ tế bào. Thu dịch nổi chứaADN plasmit, kết tủa bằng cồn rồi hoà lại cặn trong dungdịch đệm TE, ARN được loại bằng RNaza nồng độ100g/ml.I.5. Phân tích trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C.Sau khi tách chiết và tinh sạch vectơ tái tổ hợp từ tế bàochủ, gen được xác định trình tự theo phương pháp enzimhọc của Sanger nhờ bộ kit của Hãng Amersham-PharmaciaBiotech với ...