BÁO CÁO KHOA HỌC: XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTID VÙNG SIÊU BIẾN I Ở NGƯỜI VIỆT NAM

ADN của hệ gen ty thể ở người có 16 569 cặp bazơ với 2 vùng chính: vùng mã hoá và vùng điều khiển (Anderson, 1981). Vùng mã hoá mang thông tin di truyền cho các phân tử sinh học khác nhau tham gia vào quá trình tạo năng lượng của tế bào (13 gen mã hoá cho các phân tử protein, 22 gen mã hoá cho tRNAs và 2 gen mã hoá cho rRNA),
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTID VÙNG SIÊU BIẾN I Ở NGƯỜI VIỆT NAM"XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTID VÙNG SIÊUBIẾN I Ở NGƯỜI VIỆT NAMTrần Mỹ Linh, Vũ Thị Thư, Phan Minh Tuấn, LêQuang Huấn, Lê Trần BìnhViện Công nghệ sinh họcGIỚI THIỆUADN của hệ gen ty thể ở người có 16 569 cặp bazơ với 2vùng chính: vùng mã hoá và vùng điều khiển (Anderson,1981). Vùng mã hoá mang thông tin di truyền cho các phântử sinh học khác nhau tham gia vào quá trình tạo nănglượng của tế bào (13 gen mã hoá cho các phân tử protein,22 gen mã hoá cho tRNAs và 2 gen mã hoá cho rRNA),vùng điều khiển chịu trách nhiệm điều khiển phân tửmtADN (Parsons et al, 1997; Hagelberg et al. 1987; Lee etal. 1999). Trong vùng điều khiển lại chứa 2 vùng biến đổicó sự khác nhau rất lớn trong quần thể (Greenberg et al.1983), chúng được gọi là vùng siêu biến I (342 cặp bazơ)và vùng siêu biến II (268 cặp bazơ). ADN có tính bảo thủcao trong các thế hệ do chúng được cấu tạo dạng mạchvòng nên ít chịu sự tác động của các tác nhân gây đột biến,hơn nữa không có hiện tượng tái tổ hợp như ADN nhân vìchúng chỉ có một bản sao từ mẹ (Case and Wallace 1981;Giles et al. 1980). Mặt khác, ADN ty thể lại có sự đa hìnhcao nhờ sự có mặt của 2 vùng siêu biến (Budowle et al.1999, Kalmar at al. 2000).Các công trình nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin củahệ gen ty thể không chỉ giúp ta xác định mối quan hệ huyếtthống mà còn giúp ta xác định đặc trưng di truyền ngoàinhân của mỗi dân tộc, mỗi bộ tộc ở các vùng địa lý khácnhau. Đặc trưng di truyền này có sự liên quan như thế nàotới tần suất xuất hiện các bệnh hiểm nghèo (như các bệnhung thư , các bệnh về gen ...) của các dân tộc đã và đangđược các nhà nghiên cứu quan tâm nhằm xác định mối liênquan trực tiếp của chúng, giúp cho việc phòng ngừa và điềutrị có hiệu quả các căn bệnh nan y.Hiện nay, chúng ta chưa có nghiên cứu nào về hệ gen ty thểcủa các dân tộc sinh sống trên lãnh thổ Việt Nam. Chính vìvậy, để góp phần xây dựng hướng nghiên cứu mới, trongbài này chúng tôi trình bày những kết quả đầu tiên trongviệc xây dựng phương pháp nghiên cứu vùng siêu biến Itrong ADN ty thể của người Việt Nam.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPVật liệuADN ty thể được tách chiết từ các mẫu tóc, máu của ngườikhoẻ mạnh. Cặp mồi nhân đoạn gen vùng siêu biến I trongD-loop: LOOP460F: 5’-CTCCACCATTAGCACCCAAAGC-3’, LOOP460R: 5’-CAC GGAGGATGGTGGTCAAG-3’ đặt của hãngPharmacia Biotech. Vector pCR2.1, của hãng Invitrogen.Các enzim hạn chế EcoR I, enzim T4 ligaza của hãng NewEngland Biolabs, các hoá chất khác sử dụng trong thínghiệm đều là những hoá chất tinh khiết của các hãngSigma và Merck.Phương pháp tách chiết ADN từ các mẫu máuADN thu được từ các mẫu máu đã chống đông bằng EDTAtheo quy trình dưới đây có độ tinh sạch cao và có thể sửdụng cho các thí nghiệm về sinh học phân tử như PCR, cắtenzym hạn chế... Mẫu máu (1ml) máu trộn đều với đệm SSC (0,8 ml),1.ly tâm 12 000 vòng/phút thời gian 1 phút. Loại bỏ dịch lytâm. Thêm 1ml đệm SSC, vortex, sau đó ly tâm như trên và2.loại bỏ hoàn toàn dịch ly tâm. Thêm 375 l 0,2M NaOAc, vortex, sau đó thêm 25l3.SDS 10% và 5 l proteinase K (20mg/ml H2O), vortex, ủ 1giờ ở 550C. Thêm 120 l phenol:chloroform:isoamylalcohol4.(25:24:1), vortex, ly tâm 2 phút, tốc độ 12 000 vòng/phút.Hút lớp nước phía trên vào ống mới, thêm 1ml cồn 100%lạnh, ủ ở –200C, 15 phút. Ly tâm 2 phút, tốc độ 12 000 vòng/phút, làm khô mẫu5.5 phút. Thêm 180 l TE, vortex và ủ 550C trong 10 phút. Sau6.đó thêm 20 l 2M Sodium acetate, trộn đều, thêm 500 lethanol 100% lạnh, ly tâm 12000 vòng/phút thời gian10phút. Loại bỏ dịch ly tâm, rửa chất tủa với 1ml cồn 80%, ly7.tâm 1 phút với tốc độ 12 000 vòng/phút. Hoà mẫu ADN thu được trong 200 l TE, ủ qua đêm ở8.550C. Sau đó bảo quản ở –200C.Phương pháp tách chiết ADN từ các mẫu tóc Các sợi tóc được rửa sạch bằng cồn sau đó bằng nước1.cất. Cắt ngắn các sợi tóc, ủ với đệm chiết qua đêm ở 560C2.(Đệm chiết gồm 10 mM Tris, 100 mM NaCl, 39 mM DTT,10 mM EDTA and 2% SDS, proteinase K, 10g/ml). Chiết 1 lần với phenol: chloroform: isoamyl alcohol3.(25:24:1), 2 lần với chloroform. Dịch chiết chứa ADN được cô đặc trong ống4.Microcon-100 (Amicon).Nhân đoạn gen vùng siêu biến và xác định trình tựNhân đoạn gen vùng siêu biến được tiến hành với cặp mồiLOOP460F/ LOOP460R và chu trình nhiệt như sau: 940C-3phút và 35 chu kỳ ( 940C-30 giây, 560C-1 phút, 680C-1 phút30 giây), ổn định 8 phút ở 720C và kết thúc ở 40C. Sảnphẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector pCR2.1, sau đóplasmid tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn E.coli chủngDH5. Các kỹ thuật tách chiết ADN plasmid và ADN tái tổhợp được tiến hành theo Sambrook và cộng sự [10]. Trìnhtự đoạn gen vùng siêu biến I được Công ty “BIOSERVICEUNIT”, Bangkok, Thailand xác định theo phương pháp củaSanger.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNTách ...