Báo cáo Kỹ thuật di truyền: Kỹ thuật Aflp (amplified fragments length polymorphism)

Báo cáo Kỹ thuật di truyền: Kỹ thuật Aflp (amplified fragments length polymorphism) sẽ giới thiệu về kỹ thuật Aflp; nguyên tắc, hóa chất, trang thiết bị, dụng cụ; các bước tiến hành; ưu, nhược điểm; ứng dụng; kết luận và tài liệu tham khảo.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Báo cáo Kỹ thuật di truyền: Kỹ thuật Aflp (amplified fragments length polymorphism) KỸ THUẬT AFLP( AMPLIFIED FRAGMENTS LENGTH POLYMORPHISM) BỘ MÔN: KỸ THUẬT DI TRUYỀNGVHD: TS.TRẦN THỊ DUNGNHÓM THỰC HIỆN: MSSV 1. TƯỞNG THÙY NHI 61303689 2. NGUYỄN THỊ KIỀU OANH 61303701 3. ĐÀM THỊ HUYỀN 61303558 MỤC LỤC I. GIỚI THIỆU II. NGUYÊN TẮC III. HÓA CHẤT, TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ IV. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH V. ƯU, NHƯỢC ĐIỂM VI. ỨNG DỤNGVII. KẾT LUẬNVIII. TÀI LIỆU THAM KHẢO I. GIỚI THIỆU Trong những năm 1990, công ty Keygene phát triển kỹ thuật AFLP ( AmplifiedFragments Length Polymorphism). AFLP là sự kết hợp giữa RFLP (RestrictionFragments Length Polymorphism) và PCR( polymerase chain reaction) là sự đa hìnhcác đọan do cắt bởi RE và khuếch đại nhanh nhiều bản sao.  AFLP là sự đa hình các đọan khuếch đại( DNA)  AFLP là:- Một trong những kỹ thuật in dấu DNA được phát triển bởi Vos và cộng sự- Không cần biết trước trình tự DNA- Ước lượng độ đa dạng của di truyền trong và giữa những quần thể với nhau. II. NGUYÊN TẮC Tương tự RFLP, nhưng không cần tiến hành lai phân tử, dựa vào độ đặc hiệucao enzyme cắt giới hạn( RE) đối với vị trí của chúng trên DNA của gene. Sư khác biệtgiữa hai cá thể tạo ra những phân đọan cắt khác nhau.kỹ thụật AFLP gồm hai nội dung cơ bản: - Cắt DNA bằng enzyme giới hạn có bổ sung các adaptor đặc trưng cho các đọan mồi đã được chọn trước. các enzyme thường dung là EcoRI và MseI. - Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR, ngắt quãng với hai lọai mồi khác nhau, mồi của phản ứng PCR thiết kế trình tự adaptor+ trình tự vài nucleotide. Đọan DNA chứa trình tự adaptor+ trình tự nucleotide chọn lọc( khuếch đại). Các trình tự chọn lọc này:+ Giảm lượng sản phẩm PCR+ Đơn giản quá trình phân tích III. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ Nguồn: Nước và nước đã khử ion( deionized water) 1. Hóa chất 2. Trang thiết bị - Tủ lạnh, tủ đông sâu - Laminar có dòng hút khí - Máy li tâm - Máy PCR - Máy đo pH - Cân chuẩn - Máy điều chỉnh nguồn điện - Máy điện di phương thẳng đứng - Lò hâm( hotplate) - Máy giải trình tự tự động hoặc lò vi sóng - Máy soi bằng cực tím 3. Dụng cụ Các lọai micropipette và pipette tip tương ứng( đầu côn) Các lọai tube eppendorf Cồi chày sứ Găng tay IV. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 1. Phân lập DNA Phá vỡ màng tế bào: nghiền tế bào hoặc mô trong một hỗn hợp dung dịchđệm chiết lọai bỏ các thành phần không mong muốn( thường là protein) tủa DNA => bảo quản ở -20C 2. Digestion và LigationDùng hai enzyme giới hạn EcoRI có trình trình tự nhận biết 6 base, và MseI( thường có 256 bases) có trình tự nhân biết 4 base, cắt khuôn thành những phânđọan. Hai enzyme giới hạn này được sắp xếp lại nhờ kết hợp với hai hai adaptor cócấu trúc làm cho dây DNA không trở lại hình dạng ban đầu. MseI 5’TTAA3’ EcoRI 5’GAATTC3’Nối EcoRI adaptor và MseI adaptor, là những oligonucleotide, sợi đôi gắn vào haiđầu phân đọan DNA. Cấu trúc của hai adaptor: EcoRI site: 5 CTCGTAGACTGCGTACC 5 AATTGGTACGCAGTCTAC MseI site: 5 GACGATGAGTCCTGAGSau đây là mô hình của 2 hiện tượng trên DNA sequence with //-------GAATTC------//------TTAA------// EcoRI and MseI //-------CTTAAG------//------AATT------// recognition sequences EcoRI MseI//-------G AATTC------//------T TAA------////-------CTTAA G------//------AAT T------// DNA restrictionChạy PCR với các lọai mồi chọn lọc, các mồi này được cấu tạo gồm 3 phần: Trìnhtự nòng cốt( CORE), trình tự enzyme( ENZ), trình tự chọn lọc (EXT). Nhờ vậy, nhữngphân đoạn có Nu bổ sung với Nu chọn lọc được nhân lên. Những đọan DNA ngắn cóchứa một đầu là primer MseI và một đầu là EcoRI được khuếch đại đáng kể, DNAgắn hai đầu là EcoRI ít khuếch đại hơn , DNA gắn hai đầu là MseI => đóng vòng.Sản phẩm tiền khuếch đại được pha loãng được dùng làm vật liệu để khuếch đạivới đọan mồi huỳnh quang . 3. Khuếch đạiSản phẩm PCR của bước tiền khuếch đại được dùng làm khuôn cho bước khuếchđại sau đó, sử dụng primer có gắn 3 Nu chọn lọc ở đầu 3’ và chỉ EcoRI được đánhdấu huỳnh quang ở đầu 5’. Vì vậy những sợi chứa EcoRI được phát hiện trên máyABI 310. Phản ứng được ...