Tiểu luận: Kỹ thuât di truyền

Chúng tôi đã thử nghiệm chuyển gen thành công với 2 PP.chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens và bắn gen trên.lan hồ điệp dựa trên nguồn vật liệu ban đầu là PLBs được nuôi.trên MT lỏng tĩnh.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tiểu luận: Kỹ thuât di truyềnTrường ĐH VĂN LANG Khoa CNSH Lớp K14s1 Bài thuyết trình:• Thành viên: Trương Thị Thu Hiền Nguyễn Thị Kim Phụng Phan Thị Như Mai Nguyễn Xuân Lam Phan Thị Mỹ Linh Phạm Thị Thanh Liêm Nguyễn Thi Mai Hoa Thử nghiệm chuyển gen trên Lan Hồ Điệp * Tóm tắt1. Giới thiệu vấn đề2. Vật liệu và phương pháp3. Biện luận kết quả4. Kết luận THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN TRÊNLAN HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS AMABILIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN VÀ AGROBACTERIUM TUMEFACIENSTác giả : Trần Lê Lưu Ly, Nguyễn Hữu Hoàng, Bùi Lan Anh, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ (Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-HCM) Tóm tắt Chúng tôi đã thử nghiệm chuyển gen thành công với 2 PPchuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens và bắn gen trênlan hồ điệp dựa trên nguồn vật liệu ban đầu là PLBs được nuôitrên MT lỏng tĩnh. Với TN chuyển gen gián tiếp, chủng A.tumefaciens C58pGV2260 mang plasmid p35SGUS- INT chứa genuidA và nptII được sử dụng và thu được kết quả biểu hiện GUStối ưu ở nồng độ acetosyringone 50 µM sau 4 ngày đồng nuôicấy. Đối với PP chuyển gen trực tiếp, chúng tôi sử dụng hệthống máy bắn gen BiolisticTM PDS-1000/He để biến nạpplasmid pBAR-GUS (chứa gen uidA và bar). KQ cho thấy, tỉ lệbiểu hiện GUS cao nhất được ghi nhận ở khoảng cách bắn 6cm, nồng độ tungsten/DNA plasmid là 500 μg/0,5 μg. 1. Giới thiệu- Lan Hồ Điệp- Với mục tiêu bước đầu thử nghiệm quy trình, chúng tôi tiến hành biến nạp plasmid p35SGUS- INT và pBAR-GUS vào Lan Hồ Điệp bằng PP gián tiếp nhờ VK Agrobacterium tumefaciens và PP trực tiếp bằng súng bắn gen nhằm tạo tiền đề cho các nghiên cứu chuyển gen mục tiêu về sau. Môi trường HY : dịch chiết nấm men 2. Vật liệu và phương pháp 7g N-Z amine 3g Manitol 10g Dịch chiết bắp 4g a. Vật liệu MgSO4.7H2O 0,1g pH= 7,4a.1. Vật liệu cấy và MT nuôi cấy : PLB (Protocorm Like Body) có nguồn gốc từ lá của giống Lan Hồ Điệp được nuôi trên môi trường HY bổ sung 30 g/l glucose, NAA 0,5 mg/l và BAP 2 mg/l bằng PP lỏng tĩnh trong 2 tháng. Lát mỏng (1 – 2 mm) của các PLB này được sử dụng làm mẫu cấy trong tất các thí nghiệm chuyển gen. a. Vật liệua.2.Chủng vi khuẩn và plasmid sử dụng trong chuyển gen bằng PP gián tiếp: chủng A.tumefaciens C58pGV2260 mang plasmid p35SGUS-INT chứa gen nptII và gen uidA (gusA) a. Vật liệua.3.Súng bắn gen và plasmid sử dụng trongphương pháp chuyển gen trực tiếp :Sử dụng hệ thống máy bắn gen BiolisticTMPDS-1000/He (Bio-Rad) để biến nạp plasmidpBAR-GUS có gen uidA (gusA) và gen bar (genkháng PPT trong thành phần thuốc diệt cỏ ) b. Phương pháp Vi đạn được chuẩn bị theo PP củaVi khuẩn A.tumefaciens được MT LB : 10g/l tryptone và cộng sự (1993) Sanfordnuôi cấy lắc qua đêm ở 22oC vớ nồng độtrong MT LB lỏng, bổ 5g/l dịchichiết NM 500µg tungsten/0,5 µgsung rifampicin (50 mg/l) và 8g/l NaCl plasmid. Mẫu PLB được xếp DNAkanamycin (50 mg/l). Pha PH= 7,2 thành một vòng tròn trên đĩa kín Petri chứa môi trường HY rắn bổloãng sinh khối vi khuẩn bằng sung 30 g/l glucose, NAA 0,5 mg/l vàMS (OD600 = 0,8) và bổ sung BAP 2 mg/l. Thực hiện quy trìnhacetosyringone (AS) sao cho bắn gen với áp suất khí heliumnồng độ cuối cùng là 25 – 300 1100 psi và các khoảng cách đặt môμM. Sau 4 ngày đồng nuôi cấy mục tiêu trong buồng bắn lần lượtvới vi khuẩn ở 22oC ủ tối, các là 6, 9, 12 cm. Sau khi bắn được 48mẫu cấy được đem đi thử GUS giờ, các mẫu được đem đi thử GUS. Chuyển gen Thử GUSCác mẫu sau khi chuyển gen được thử GUS.Hoạt tính GUS thể hiện qua sự phân giảicơ chất 5-bromo-4-chloro-3-indolylglucuronide (X-Gluc) của enzyme B-glucuronidase (sản phẩm của gen gusA) thànhchất có màu xanh chàm đặc trưng trên cácvùng mô nhận gen chuyển. Theo dõi mức độvà % mẫu biểu hiện gus cho phép khẳng địnhtạm thời hiệu suất biến nạp gen. ...