Báo cáo thực hành môn Sinh học phân tử - Kỹ thuật di truyền

Tài liệu tham khảo Báo cáo thực hành môn Sinh học phân tử - Kỹ thuật di truyền gồm báo cáo: Bài 1 Tách chiết DNA tổng hợp, Bài 2 Điện di trong Gel Agarose, Bài 3 Kỹ thuật PCR.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Báo cáo thực hành môn Sinh học phân tử - Kỹ thuật di truyền TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN KHOA CNSH &CNTP ------------ BÁO CÁO THỰC HÀNHMÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ KỸ - THUẬT DI TRUYỀN Giảng viên: ThS. Dương Hữu Lộc Sinh viên: Đỗ Thị Hào Lớp: CNSH43 Thái Nguyên, 2013 1 Bài 1 TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐI. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM 1.1 Mục đích Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA ra khỏi cấu trúcbao bọc của tế bào, để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng sinh học phântử. Điều quan tâm là thu nhận được các phân tử DNA ở trạng thái nguyên vẹnkhông bị phân hủy. 1.2 Đối tượng : Lá đậu tương.II. VẬT TƯ – HÓA CHẤTTT Tên dụng cụ, hóa chất Số lượng Ghi chú 1 Cồn tuyệt đối 1 lít Dụng cụ dạng thìa nhựa 2 2 10 chiếc mm 3 Ống fancol 10 chiếc 4 Bộ micropipet 2 bộ Kèm 30 đầu côn các loại 5 Ống eppendorp loại 2 ml 30 chiếc Ghi sẵn thứ tự theo số mẫu 6 Ống eppendorp loại 1,5 ml 30 chiếc Ghi sẵn thứ tự theo số mẫu 7 Máy ổn nhiệt 1 máy 8 Máy lắc (votex) 1 máy 9 Máy ly tâm 1 máy10 Máy spindown 1 máy11 Tris HCl 1M, pH = 8 6 ml12 NaCl 5M 5,6 ml13 EDTA 0,5 M, pH = 8 1,2 ml14 CTAB 4% 0,8 gam 215 NaH 2PO4 0,16 gam16 Sorbitol 2M 7 ml17 Isoamyl 0,75 ml18 Cloroform 18 ml19 Isopropannol 100% 15 ml20 Nước cất 1 lít21 Nước cất đã khử ion 6 ml Cách pha hóa chất.1) Đệm CTAB 100 ml gồm: - CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) : 2,25 gam - β - Mercapto ethanol : 250 µl - EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : 4,5 ml - NaCl 5M : 30 ml - Tris HCl (pH= 8,0) : 15 ml - H2O : 55 ml- Dung dịch đệm CTAB có tác dụng phá màng tế bào , bào quan, giải phóng raDNA.- EDTA có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme DNase, bảo vệ DNA, phá vỡliên kết hóa trị II và do đó làm giảm tính bền vững của lớp màng ngoài tế bào vikhuẩn2) Đệm TE (Tris - EDTA) pH=8,0 gồm: - Tris HCl (pH=8,0) :10 mM - EDTA (pH=8,0) : 1mM3) Enzyme RNase : 10 µg/ml4) Cồn tuyệt đối lạnh : 50 ml 35) NaCl 5M : 20 ml6) Dung dịch chloroform:isoamylalcohol (24:1)- Chloroform không tan trong nước, do đó khi bổ sung vào dịch nuôi tế bào sẽlàm cho dịch này phân thành 2 lớp( pha). Hỗn hợp ly tâm mạnh để phân táchlớp. Protein bị kết tủa sẽ nằm ở pha giữa.- Isoamylancohol là 1 ancohol với sự có mặt của cation hóa trị I ( Na+, K +,NH 4+) có tác dụng làm kết tủa DNA.7) Dung dịch phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1)8) Dung dịch rửa mẫu là ethanol 70%:- Sử dụng cồn tuyệt đối để loại bỏ một số muối lẫn tạp trong dung dịch màchúng kết tủa theo DNA.III. CÁCH TIẾN HÀNH 3.1. Nguyên tắc Nguyên tắc tách chiết DNA từ tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn lànhư nhau. Tuỳ từng loại mẫu phẩm sinh học, tuỳ từng mục đích nghiên cứu vàđiều kiện phòng thí nghiệm có thể sử dụng các kỹ thuật tách chiết với các loạihoá chất và dung môi khác nhau. Các phương pháp tách chiết DNA thường được dùng gồm: 1. Phương pháp CTAB 2. Phương pháp PVP 3. Phương pháp phenol/chloroform 4. Phương pháp Silica 5. Phương pháp Guanidine-chloroform. Trong phạm vi bài giảng thực hành này sẽ giới thiệu cách tách chiết DNAtổng số theo phương pháp CTAB (Cetyl threemetyl amomnium bromide) -phương pháp 1. Do tác giả Gawel và cộng sự đưa ra năm 1991 và đã có sự cảitiến. Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở sử dụng kết hợp cơ học lànghiền và các hóa chất để phá vỡ vật liệu ban đầu là màng nhân, tạo thành hỗn 4hợp đựng trong các ống Ependorp. Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, các hóachất và loại bỏ những thành phần không mong muốn, từ đó thu nhận DNA. 3.2. Quy trình tách DNA (Gồm 10 bước) - Bước 1: Tiến hành thu mẫu (mẫu lá), gói bằng giấy bạc để ngay vào ...