BÁO CÁO ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI BA LOÀI VI KHUẨN

Qui trình PCR phát hiện đồng thời ba loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila và Flavobacterium columnare được thực hiện và chuẩn hóa. Cặp mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng để khuếch đại đoạn đặc hiệu trên gen 16S RNA của E. ictaluri với sản phẩm PCR là 407 bp, gen Aerolysin của A. hydrophila với sản phẩm PCR là 209 bp và vùng ITS (internal transcribed spacer) của gen 16S-23S rRNA của F. columnare với sản phẩm PCR là 504 bp. Độ nhạy của qui trình là 10 ng DNA chiết tách từ vi khuẩn...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO " ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI BA LOÀI VI KHUẨN "Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 241-249 Trường Đại học Cần Thơ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI BA LOÀI VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila VÀ Flavobacterium columnare Nguyễn Hà Giang1, Trần Việt Tiên1 và Đặng Thị Hoàng Oanh1 ABSTRACTA PCR protocol for simultaneous detection of Edwardsiella ictaluri,Aeromonas hydrophila and Flavobacterium columnare bacteria was optimized.The forward and reverse primers were used to amplify a unique sequence of16S RNA gene of E. ictaluri with a PCR product of 407 bp, aerolysin gene of A.hydrophila with a PCR product of 209 bp and a segment in the internaltranscribed spacer (ITS) of 16S-23S rRNA gene of F. columnare with a PCRproduct of 504 bp. The lower detection limit was 10 ng for E. ictaluri, A.hydrophila and F. columnare extracted DNA. The diagnostic sensitivity andspecificity of the PCR was evaluated with common bacterial isolates inaquaculture including Vibrio harveyi, V. alginolyticus, V. cholerae, Aeromonassp., A. carviae, Pseudomonas putida, Eschericchia coli, Bacillus subtilis. ThemPCR appears to have good application for rapid, sensitive, specificity andlow cost for simultaneous detection of E. ictaluri, A. hydrophila and F.columnare bacreria.Keywords: Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila, Flavobacteriumcolumnare, mPCR, diagnosis.Title: Application of multiplex PCR protocol for simultaneous detection ofEdwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila and Flavobacteriumcolumnare bacteria. TÓM TẮTQui trình PCR phát hiện đồng thời ba loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri,Aeromonas hydrophila và Flavobacterium columnare được thực hiện và chuẩnhóa. Cặp mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng để khuếch đại đoạn đặc hiệutrên gen 16S RNA của E. ictaluri với sản phẩm PCR là 407 bp, gen Aerolysincủa A. hydrophila với sản phẩm PCR là 209 bp và vùng ITS (internaltranscribed spacer) của gen 16S-23S rRNA của F. columnare với sản phẩmPCR là 504 bp. Độ nhạy của qui trình là 10 ng DNA chiết tách từ vi khuẩn chocả 3 loài E. ictaluri, A. hydrophila và F. columnare. Tính đặc hiệu của qui1 Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ 241Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 241-249 Trường Đại học Cần Thơtrình được kiểm tra với vi khuẩn phổ biến trong thuỷ sản là Vibrio harveyi, V.alginolyticus, V. cholerae, Aeromonas sp., A. carviae, Pseudomonas putida,Eschericchia coli, Bacillus subtilis. Qui trình có ứng dụng tốt để phát hiệnđồng thời E. ictaluri, A. hydrophila và F. columnare nhiễm trên cá tra nhanh,nhạy, đặc hiệu và chi phí thấp.Từ khóa: Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila, Flavobacteriumcolumnare Pangasianodon hypophthalmus, mPCR, chẩn đoán.1 GIỚI THIỆUTrong những năm gần đây nghề nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)được thâm canh hóa đặc biệt là nuôi với mật độ cao. Tuy nhiên, sự phát triểnquá nhanh của nghề nuôi cá tra mà phần lớn là tự phát, không theo một địnhhướng hay một kế hoạch, quy hoạch cụ thể nào đã dẫn đến kết quả tất yếu làtình trạng ô nhiễm môi trường, dịch bệnh xảy ra tràn lan và mầm bệnh ngàycàng đa dạng. Trong đó bệnh truyền nhiễm, nhất là bệnh do vi khuẩn đã gâynhiều thiệt hại nghiêm trọng đến sản lượng cá nuôi. Trong số các mầm bệnh vikhuẩn ở thủy sản thì vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan,Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết và phát hiện gần đây loài vi khuẩnFlavobacterium columnare gây bệnh trắng da là những tác nhân gây bệnh nổibật nhất. Hiện nay phương pháp phát hiện bệnh vi khuẩn từ cá tra được sửdụng phổ biến là sử dụng phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng kítAPI 20E (BioMerieux). Đối với 2 phương pháp này cần có thời gian phân lập,nuôi cấy và định danh thường kéo dài từ 4-7 ngày (tùy loài). Thời gian chẩnđoán kéo dài như vậy thường không thể đáp ứng nhu cầu chẩn đoán bệnh trongnuôi cá tra hiện nay. Gần đây, phương pháp PCR được ứng dụng để phát hiệnsớm và nhanh vi khuẩn E.ictaluri, thời gian được rút ngắn ¼ lần so với phươngpháp định danh E. ictaluri bằng phương pháp sinh hoá (Đặng Thị Hoàng Oanhvà Nguyễn Trúc Phương, 2009). Ngoài ra, Nguyễn Hà Giang và Đặng ThịHoàng Oanh (2010) trong quá trình xác định tác nhân gây bệnh trắng da do F.columnare gây ra cũng đã áp dụng kỹ thuật PCR để định danh loài vi khuẩnnày. Qui trình PCR phát hiện E. ictaluri từ thận cá tra (Đặng Thị Hoàng Oanhvà Đặng Thụy Mai Thy, 2009) và A. hydrophila từ thận cá tra (Nguyễn HàGiang và ctv, 2009) đã được ứng dụng trong chẩn đoán bệnh do vi khuẩn ở cátra. Khi có nhiều mầm bệnh xuất hiện trong môi trường nuôi thủy sản thì khảnăng phát hiện đồng thời các mầm bệnh này được thực hiện nhờ vào một dạngbiến hóa ...