Biểu hiện gen Melatonin-R1A trên mẫu mô buồng trứng và phức hợp cumulus tế bào trứng heo ở các giai đoạn phát triển khác nhau

Nghiên cứu nhằm đánh giá sự biểu hiện gen Melatonin-R1A (gen thụ thể Melatonin receptor 1A-MTNR1A hoặc MT1) ở mức độ mRNA trên mẫu mô buồng trứng theo từng giai đoạn phát triển sinh lý của nang noãn, trên phức hợp cumulus-tế bào trứng (cumulus oocyte complexes-COC), tế bào cumulus (CC) và tế bào trứng (DO) tại các thời điểm khác nhau theo quá trình nuôi cấy thành thục nhân tế bào trứng heo in vitro.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Biểu hiện gen Melatonin-R1A trên mẫu mô buồng trứng và phức hợp cumulus tế bào trứng heo ở các giai đoạn phát triển khác nhau DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI - GIỐNG VẬT NUÔI DI TRUYỀN BIỂU HIỆN GEN MELATONIN-R1A TRÊN MẪU MÔ BUỒNG TRỨNG VÀ PHỨC HỢP CUMULUS-TẾ BÀO TRỨNG HEO Ở CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN KHÁC NHAU Ngô Vũ Hà Mi1 và Nguyễn Ngọc Tấn1* Ngày nhận bài báo:12/5/2022 - Ngày nhận bài phản biện:22/6/2022 Ngày bài báo được chấp nhận đăng: 24/6/2022 TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm đánh giá sự biểu hiện gen Melatonin-R1A (gen thụ thể Melatonin receptor 1A-MTNR1A hoặc MT1) ở mức độ mRNA trên mẫu mô buồng trứng theo từng giai đoạn phát triển sinh lý của nang noãn, trên phức hợp cumulus-tế bào trứng (cumulus oocyte complexes-COC), tế bào cumulus (CC) và tế bào trứng (DO) tại các thời điểm khác nhau theo quá trình nuôi cấy thành thục nhân tế bào trứng heo in vitro. Mẫu mô thu nhận chứa nang noãn nhỏ (7mm), hoặc phức hợp COC thu nhận theo thời điểm: 0, 22 và 44 giờ sau nuôi cấy hoặc tế bào trứng và tế bào cumulus thu nhận theo thời điểm 22 giờ sau nuôi cấy. Ly trích RNA và áp dụng kỹ thuật one-step RT-PCR để khuyếch đại đoạn gen mục tiêu của MTNR1A với kích thước 388bp, sử dụng đoạn gen GAPDH với kích thước 187bp như là đối chứng nội. Sử dụng kỹ thuật bán định lượng mức độ biểu hiện bằng phần mềm ImageJ để xác định điểm ảnh cho băng biểu hiện mRNA của gen MTNR1A và GAPDH trên ảnh điện di. Kết quả cho thấy sự biểu hiện gen MTNR1A ở mức mRNA thấp nhất trong mẫu mô có chứa nang noãn nhỏ (0,72±0,14), cao dần ở nang noãn trung bình (1,20±0,06) và cao nhất ở nang noãn lớn (1,53±0,19), sự khác biệt có ý nghĩa (PDI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔI and LF. Based on maturation process,the expression of MTNR1A at mRNA in the COCs was lowest at 0h(0.59±0.06), highest at 22h (1.32±0.21) and then declined at 44h (0.72±0.18) post maturation culture, the significant difference was found between 0h and 22h (P DI TRUYỀN - GIỐNG VẬT NUÔIrửa kỹ các buồng trứng bằng PBS (Phosphate giai đoạn 2: Phản ứng PCR, tổng hợp DNA từBuffer Saline). Chuyển buồng trứng vào đĩa đoạn cDNA trên. Trình tự mồi được sử dụng:petri thủy tinh và tiến hành cắt nhỏ 0,1g MTNR1A (XM_021078041.1) với mồi xuôimẫu mô buồng trứng có chứa các nang nhỏ 5’-TATTGCTACATCTGCCACAGTC-3’và mồi(7mm) ngược 5’-TTAGAGGAGCCCAGCAAATG-3’,bằng lưỡi dao vô trùng cho vào eppendoft GAPDH (AF017079) với mồi xuôi1,5ml và nghiền. 5’-AGCAATGCCTCCTGTACCAC-3’ và mồi * Phức hợp cumulus-tế bào trứng: Việc thu ngược 5’-AAGCAGGGATGATGTTCTGG-3’.nhận phức hợp cumulus-tế bào trứng được Chu trình nhiệt độ: giai đoạn phiên mã ngượcthực hiện theo quy trình của Nguyễn Ngọc 45 °C trong 20 phút, tiền biến tính 95 oC trongTấn và ctv (2019). 1 phút, biến tính 95 oC trong 10 giây, bắt cặp trong vòng 20 giây với nhiệt độ 59 oC cho tất2.2.2. Nuôi cấy thành thục tế bào trứng cả các primer MTNR1A và GAPDH, kéo dài Sau khi thu nhận phức hợp COC từ các 72 oC trong 30 giây. Và cuối cùng hậu kéo dàinang noãn có kích thước trung bình (3-7mm), ở 72 oC trong 7 phút. Quy trình RT-PCR thựccác phức hợp COC có từ 2 lớp tế bào cumulus hiện trong 35 chu kì, sản phẩm PCR được điệntrở lên, đồng đều tế bào chất được lựa chọn di bằng gel agarose 1,5% (Bioline).đưa vào nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy thànhthục tế bào trứng là TCM 199 (chứa Earl’s salts,L-glutamine và Sodium bicarbonate) bổ sung10% dịch nang noãn, 0,8% BSA (Bovine SerumAlbumin), 100 UI/ml Penicillin G sodiumsalt và 100 UI/ml Streptomycin sulfate salttrong 44h ở điều kiện 39oC, 5% CO2. Bổ sung10 UI/ml hormone hCG (human ChorionicGonadotropin) cho môi trường nuôi cấy trong22h đầu và không bổ sung hormone trong 22hsau. Đảm bảo pH môi trường nuôi cấy 7,2-7,4(Nguyễn Ngọc Tấn và ctv, 2019).2.2.3. Thu nhận mẫu để ly trích RNA, khuếch Hình 1. Mẫu mô buồng trứng và phức hợpđại đoạn gen MTNR1A cumulus-tế bào trứng thu nhận Mẫu mô chứa nang noãn có kích thước 2.2.4. Nội dungnhỏ (A), trung bình (B), lớn (C) được cắt nhỏ;COC thu từ nang noãn trung bình theo giai 1. Xác định sự biểu hiện của gen thụ thểđoạn 0h (D), 22h sau nuôi cấy (E), 44h sau MTNR1A ở mức độ mRNA trong mẫu mô buồngnuôi cấy (F); tế bào cumulus (G) và tế bào trứng theo từng giai đoạn phát triển sinh lý củatrứng (H) thu từ nang noãn trung bình ở thời nang noãn. Mẫu mô có chứa các nang noãnđiểm 22h sau nuôi cấy (Hình 1) được đưa có kích thước khác nhau được sử dụng đểvào ly trích RNA và ủ với DNaseI để loại bỏ đánh giá mức độ biểu hiện của gen thụ thểDNA. Sử dụng kỹ thuật RT-PCR để khuếch MTNR1A ở mức độ mRNA.đại đoạn gen mục tiêu của MTNR1A với 2. Xác định sự biểu hiện của gen thụ thểkích thước 388bp và đoạn gen GAPDH với MTNR1A ở mức độ mRNA trong phức hợp COCkích thước 187bp như là đối chứng nội. Thực thu từ nang noãn có kích thước trung bình t ...