Bước đầu sử dụng Lectin đậu dao biển (Canavalia Maritima, Aublet) trong định lượng kháng thể IgG từ huyết thanh người

Bài viết nghiên cứu và tinh chế IgG từ huyết thanh người khỏe; xây dựng đồ thị chuẩn IgG, thăm dò nồng độ gắn bản của ConM và độ pha loãng của huyết thanh; bước đầu sử dụng Lectin ConM định lượng kháng thể IgG trong huyết thanh người bình thường.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bước đầu sử dụng Lectin đậu dao biển (Canavalia Maritima, Aublet) trong định lượng kháng thể IgG từ huyết thanh người32(1): 63-66 T¹p chÝ Sinh häc 3-2010 B−íc ®Çu sö dông lectin ®Ëu dao biÓn (Canavalia maritima,Aublet) trong ®Þnh l−îng kh¸ng thÓ IgG tõ huyÕt thanh ng−êi TrÇn ThÞ Ph−¬ng Liªn, Tr−¬ng V¨n Ch©u Tr−êng ®¹i häc S− ph¹m Hµ Néi 2 §ç V¨n Phóc, §ç Ngäc Liªn Tr−êng ®¹i häc Khoa häc tù Nhiªn, §HQG Hµ Néi §Ëu dao biÓn (Canavalia maritima, Aublet) 2. Ph−¬ng ph¸pcã nguån gèc tõ Brazil, th−êng sèng ë c¸c vïng Tinh chÕ kh¸ng thÓ IgG tõ huyÕt thanh b»ngnhiÖt ®íi ven biÓn vµ còng ®−îc liÖt kª vµo c¸c cét s¾c kÝ ¸i lùc Protein A - Sepharose 4B vµ cétloµi c©y ®Ëu ¨n h¹t ë c¸c vïng §«ng Nam ¸ ConM - Sepharose 4B tù t¹o [3].[2, 4]. Cïng víi loµi ®Ëu rùa th−êng mäc ë rõngnói (Canavalia ensiformis D. C.) vµ ®Ëu g−¬m §¸nh gi¸ møc ®é tinh s¹ch cña IgG ®I tinh(Canavalia gladiata (Jacq) D. C.) ®I ®−îc t×m chÕ b»ng kü thuËt ®iÖn di trªn gel SDS-PAGEthÊy ë ViÖt Nam [2], c¸c loµi nµy ®Òu chøa mét theo Laemmli, víi nång ®é 12% [3].lo¹i protein ®−îc gäi chung lµ lectin cã ho¹t tÝnh Sö dông lectin ConM cã ®é tinh s¹ch cao tõng−ng kÕt hång cÇu lµ ConA (tõ C. ensiformis), h¹t ®Ëu dao biÓn ®I ®−îc tinh chÕ b»ng ph−¬ngconG (tõ C. gladiata) vµ ConM (tõ C. maritima) ph¸p s¾c kÝ ¸i lùc theo Goldstein vµ céng sù[5, 6]. TÝnh chÊt ®iÓn h×nh cña lectin lµ cã kh¶ (1986) ®Ó b−íc ®Çu ®Þnh l−îng kh¸ng thÓ IgAn¨ng liªn kÕt víi c¸c gèc ®−êng ®¬n vµ c¸c gèc trong huyÕt thanh b»ng kü thuËt LECTIN-®−êng n»m trªn bÒ mÆt tÕ bµo [7]. øng dông ELISA [3].tÝnh chÊt nµy, nh÷ng n¨m cuèi cña thÕ kû XX, C¸c ho¸ chÊt sö dông cña hIng Sigma (Mü),c¸c nhµ khoa häc ®I sö dông lectin ®Ó nghiªn Merk (§øc), LKB (Thuþ §iÓn): Protein chuÈn;cøu sù biÓu hiÖn kh¸ng thÓ vµ kh¸ng nguyªn. V× Sepharose-ProteinA; SephadexG-G75; céng hîpvËy viÖc sö dông lectin ConM tõ h¹t ®Ëu dao kh¸ng IgG; c¬ chÊt OPD, c¸c ho¸ chÊt nµy ®¹tbiÓn (Canavalia maritima, Aublet) ®Ó ®Þnh møc ®é tinh khiÕt cao.l−îng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh ng−êi lµ ®iÒucÇn thiÕt cã ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn y häc. II. KÕt qu¶ nghiªn cøu 1. Tinh chÕ IgG tõ huyÕt thanh ng−êi kháe I. ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu1. Nguyªn liÖu H¹t ®Ëu dao biÓn ®−îc thu h¸i t¹i khu vùcch©n nói Ngò Hµnh, Qu¶ng Nam §µ N½ng, doNguyÔn §¨ng Kh«i ®Þnh lo¹i. Hång cÇu ®−îc viÖn HuyÕt häc vµ truyÒnm¸u Trung −¬ng cung cÊp gåm c¸c nhãm m¸uA, B, O ®−îc röa 3 lÇn víi muèi sinh lý(NaCl 0,9%). H×nh 1. §iÖn di SDS-PAGE chÕ phÈm IgG tinh s¹ch C¸c mÉu huyÕt thanh ng−êi kháe b×nh Ghi chó: Cét 1. C¸c protein chuÈn cña hIng SIGMA;th−êng ®I ®−îc chuÈn ®o¸n l©m sµng ®−îc Cét 2. IgG tinh s¹ch tinh chÕ b»ng cét ConM-ViÖn HuyÕt häc vµ TruyÒn m¸u Trung −¬ng Sepharose 4B; Cét 3. IgG tinh s¹ch tinh chÕ b»ng cétcung cÊp. ConM-Sepharose 4B. 63 IgG ®−îc tinh chÕ b»ng cét ConM- KÕt qu¶ nµy ®I chøng tá r»ng lectin ConMSepharose 4B tù t¹o vµ cét Protein A - Sepharose liªn kÕt ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ IgG mµ kh«ng4B. ChÕ phÈm IgG tinh s¹ch ®−îc dïng ®Ó x©y hÒ liªn kÕt víi c¸c thµnh phÇn nµo kh¸c trongdùng ®å thÞ tiªu chuÈn cho kü thuËt xÐt nghiÖm huyÕt thanh ng−êi.LECTIN-ELISA khi dïng lectin ConM g¾n b¶n. 2. X©y dùng ®å thÞ chuÈn IgG KÕt qu¶ chÕ phÈm IgG thu ®−îc hoµn toµn Kh¸ng thÓ IgG tinh s¹ch sau khi tinh chÕtinh s¹ch, chØ biÓu hiÖn 2 b¨ng duy nhÊt lµ chuçi ®−îc sö dông ®Ó x©y dùng ®å thÞ chuÈn cho künÆng (53 kDa) vµ chuçi nhÑ (25 kDa) khi kiÓm thuËt xÐt nghiÖm ELISA. KÕt qu¶ thu ®−îc ëtra b»ng kü thuËt SDS-PAGE (h×nh 1). h×nh 2. 1.2 OD 490nm 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Hµm l−îng IgG (ng/ml) H×nh 2. §å thÞ chuÈn IgG Qua ®å thÞ chuÈn (h×nh 2) cho thÊy khi mËt HuyÕt thanh ng−êi b×nh th−êng ®−îc pha®é quang n»m trong kho¶ng tõ 0,196 ®Õn 0,698 loIng 150, 200, 250 lÇn trong ®Öm blocking pHth× kÕt qu¶ thùc nghiÖm thu ®−îc t−¬ng ®−¬ng 7,6-7,8; ConM ®−îc g¾n b¶n víi c¸c nång ®é 1, 3,víi kÕt qu¶ lÝ thuyÕt. V× vËy, trong qu¸ tr×nh lµm 5, 8, 10, 15 µg/1 giÕng ®Ó b¾t gi÷ IgG trong küthùc nghiÖm cÇn l−u ý ®é pha loIng huyÕt thanh thuËt Lectin-Elisa (h×nh 3).sao cho kÕt qu¶ ®o mËt ®é quang n»m trong KÕt qu¶ h×nh 3 cho thÊy, ®Ó thÝch hîp chokho¶ng tõ 0,196 ®Õn 0,698. viÖc ®Þnh l−în ...