Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn

Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization):Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới. Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi sinh vật và bảo quản được trong một thời gian dài.Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tại NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh).1, Nuôi vi khuẩn cho đông khô: Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn Bảo quản vi khuẩn: a. Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization): Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vậttrên thế giới. Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của visinh vật và bảo quản được trong một thời gian dài. Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tạiNCTC (National Colleciton Type Culture, Anh). 1, Nuôi vi khuẩn cho đông khô: Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên,cũng có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậmđặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tếbào nằm trong pha sinh trưởng log. 2, Chuẩn bị đệm mẫu: Có thể dùng một trong hai loại đệm sau: + Đệm huyết thanh- inositol; Meso-inositol: 5 gam Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào cácbình vô trùng. + Đệm inositol: Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam Meso-inositol: 5 gam Nước cất: đủ 100 ml. Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121OC. 3, Chuẩn bị dịch tế bào: Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bảo quản. Thôngthường có thể thu sinh khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 1-2 ml đệmpha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào. Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010(đối với vi sinh vật không có bào tử). Mật độ trên có thể giảm với các vi sinh vậtcó bào tử. Hai đệm pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trườnghợp enterobacteria thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tínhmiễn dịch của vi khuẩn. 4, Chuẩn bị ống đông khô: Ống đông khô được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm với dịch acid lo ãng (HCl2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống được thanh trùng khôhoặc khử trùng theo phương pháp thông thường. 5, Chuẩn bị mẫu trước khi đông khô: Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet pasteur vàoống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml. Chú ý mọi thao tác phải cẩn thận tránh dínhmẫu vào thành hay phía trên của ống đông khô. 6, Bước tiền đông khô: Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước có thể bị lạnh đông tạo đá.Trước khi tiến hành đông khô mẫu được chuẩn bị qua bước tiền đông (như trìnhbày ở trên) sau đó bước tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ thốngđông khô và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành khoảng 3giờ. 7, Tạo chỗ thắt trên ống đông khô: Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt. Việc tạo vết thắt đượcthực hiện với hệ thống đèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay các cơ sở bảo quản vi sinh vậtsử dụng hệ thống hàn và tạo vết thắt trên thiết bị tự động. 8, Hậu đông khô: Trong bước này mẫu lại tiếp tục được làm khô cho đến độ ẩm cuối cùng đạtkhoảng 1%. Thời gian cho bước này có thể thay đổi từ 1-2 giờ. 9, Hàn ống đông khô: Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệmvà cẩn thận. Trước hết phải tiến hành khoá van và sau đó mới thực hiện thao táchàn ống đông khô. 10, Kiểm tra độ chân không của ống đông khô: Người ta sử dụng thiết bị là đèn phát hiện mức độ chân không. Với các mẫuđạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt. Đối với các mẫukhông đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc màu tím đậm. 11, Kiểm tra khả năng sống của mẫu: Đếm số lượng tế bào là phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảoquản. Việc đếm được thực hiện trước khi và ngay sau khi đông khô. Các bướckiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượngcủa mẫu đông khô. Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có b ào tử cao hơn visinh vật không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm. Tuynhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì yêu cầu phải được tiến hành theo đúng qui trình,tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy. 12, Bảo quản mẫu: Mẫu thông thường được bảo quản tại 4OC hay nhiệt độ phòng. Phương pháp giữ trong lạnh sâu: b. 1, Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữahoặc đầu pha log. 2, Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt nồngđộ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106. 3, Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trongtrường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0.05% để pháthiện các ống bị rò rỉ). Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suấtthẩm thấu trong và ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì ...