Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo)

Các kỹ thuật chính dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp1.1. Khái niệm 1.2. Các enzym dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.3. Các vector nhân dòng dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.4. Nhân dòng gen (gene cloning) 1.5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA2.1. Kỹ thuật chiết tách DNA và RNA 2.2. Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA 2.3. Phương pháp PCR 2.4. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 2.5. Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA) 2.6....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo)LOGOChương 2: CÁC KỸ THUẬTNỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo) Nguyen Thi Viet AnhNội dung 1. Các kỹ thuật chính dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.1. Khái niệm 1.2. Các enzym dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.3. Các vector nhân dòng dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.4. Nhân dòng gen (gene cloning) 1.5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen 2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA 2.1. Kỹ thuật chiết tách DNA và RNA 2.2. Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA 2.3. Phương pháp PCR 2.4. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 2.5. Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA) 2.6. Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR (AFLP, SSR) 2.7. Genomic và proteomic www.themegallery.com2. Các kỹ thuật chính sửdụng trong phân tích DNA  Ngân hàng bộ gen:  Thư viện DNA từ bộ gen (lắc cơ học, RE);  Khái niệm ngân hàng bộ gen (Bank of genomic DNA): • Đoạn DNA được tách dòng (khác nhau do tế bào, bộ gen, RE,…); • Bao gồm exon và intron; • VD: ngân hàng bộ gen của vi khuẩn; • tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen và đã được tách dòng trong tế bào chủ; • Đầu tiên DNA 300.000-400.000 bp gắn vào YAC hoặc BAC, cắt đoạn nhỏ trung bình 30.000-40.000 bp gắn vào cosmid, cuối cùng là các đoạn trung bình 4.000 bp gắn vào plasmid để giải kí tự chuỗi. www.themegallery.com2. Các kỹ thuật chính sửdụng trong phân tích DNA Bước 1: Dùng enzyme cắt giới hạn Bước 2: DNA bị cắt thành nhiều đoạn khác nhau Bước 3: đoạn DNA được đưa vào vector www.themegallery.comNgân hàng cDNA  Bộ gen Eukaryotae (1,7% gen người-mã hoá protein);  Tập hợp cDNA được tổng hợp nhờ kỹ thuật phiên mã ngược mRNA tương ứng (cDNA=complementary DNA);  Exon;  Enzyme reverse transcriptase, DNA polymerase;…  cDNA từ những đoạn gen đã được phiên mã ra mRNA (khác biệt tuỳ vào tế bào của mô đã được biệt hoá và giai đoạn biệt hoá) tổng hợp các ngân hàng cDNA trong từng loại tế bào, từng loại mô của các cơ quan sẽ hình thành nên ngân hàng cDNA của một cơ quan nào đó.  VD: rễ lúa www.themegallery.comwww.themegallery.comwww.themegallery.comKỹ thuật tạongân hàng cDNA Kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA:  Tách chiết và tinh sạch mRNA của tế bào;  Sử dụng kỹ thuật PCR: các đoạn mồi (primer) đặc hiệu, các loại nucleotide tự do, DNA polymerase…  mRNA tổng hợp nên cDNA;  Enzyme RNase H để phân huỷ sợi khuôn RNA;  Tổng hợp sợi đơn cDNA thứ 2 www.themegallery.comKỹ thuật tạongân hàng cDNA Kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA: có 2 nhóm phương pháp chủ yếu:  Phiên mã ngược bằng phân huỷ hoàn toàn sợi khuôn mRNA (cDNA có cấu trúc kẹp tóc-hairpin loop, S1 nuclease cắt bỏ);  Phiên mã ngược tạo cDNA theo kỹ thuật RACE (rapid amplification of cDNA ends): kỹ thuật nhân nhanh đầu cuối cDNA.  Video cDNA libraries www.themegallery.comKỹ thuật tạongân hàng cDNA Ưu điểm sử dụng ngân hàng cDNA:  Các dòng c-DNA chứa trình tự mã hoá liên tục của một gen;  Những tế bào chuyên hoá sẽ tạo ra số lượng lớn của 1 loại protein;  Dễ chiết tách; giảm nhẹ việc xác định đúng dòng mong muốn từ ngân hàng gen. www.themegallery.comPhương pháp PCR PCR = Polymerase chain reaction: phản ứng polymerase dây chuyền:  Khuếch đại một lượng lớn đoạn DNA trong điều kiện in-vitro;  Trong ống nghiệm plastic nhỏ (ependoff);  Khác hẳn với sự tạo dòng các đoạn DNA bằng tế bào vi khuẩn hay nấm men; www.themegallery.comPhương pháp PCR Nguyên tắc thực hiện:  Sự khuếch đại nhờ vào chu trình nhiệt lập lại (~35 lần) gồm các bước: 1. Đun nóng, biến tính (950C); 2. Làm nguội, gắn mồi (37-650C); 3. Ủ dài, tổng hợp (720C).  Sử dụng các đoạn mồi (primer) để bắt cặp bổ sung với đầu đoạn mạch tương ứng;  DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, vi khuẩn Thermophilus aquatus) www.themegallery.comPhương pháp PCR www.themegallery.comPhương pháp PCR Phản ứng PCR:  Khuôn mẫu (DNA cần khuếch đại);  Các đoạn mồi (primer ~18-25 Nucleotide);  DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase);  Các nucleotide tự do (dNTP);  Dung dịch đệm thích hợp;  Video phản ứng PCR www.themegal ...