Chương 2: Công nghệ DNA tái tổ hợp

Tham khảo tài liệu chương 2: công nghệ dna tái tổ hợp, khoa học tự nhiên, công nghệ sinh học phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chương 2: Công nghệ DNA tái tổ hợpChương 2 Công nghệ DNA tái tổ hợpI. Mở đầu Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờsự phát triển của các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu cácquá trình sinh học ở mức độ phân tử. Từ đó, cho phép phân lập, phân tích vàthao tác trên các nucleic acid theo nhiều phương thức khác nhau, giúp hiểubiết sâu sắc các lĩnh vực mới của sinh học như công nghệ sinh học, bào chếcác loại thuốc mới, y học phân tử và liệu pháp gen. Sự khám phá ra các enzyme hạn chế (restriction endonuclease) trongnhững năm đầu 1970 là sự phát triển then chốt (key development) không chỉcho khả năng phân tích DNA hiệu quả hơn, mà còn cung cấp khả năng cắtcác phân tử DNA để tạo ra các đoạn DNA tái tổ hợp mới, một quá trình màngày nay được gọi là tạo dòng gen (gene cloning). Phương thức tạo dòngnày đã báo hiệu một kỷ nguyên mới trong thao tác, phân tích và khai tháccác phân tử nucleic acid. Tạo dòng gen đã cho ra nhiều phát minh quan trọng và cung cấpnhững hiểu biết giá trị trong cấu trúc, chức năng và sự điều hòa hoạt độngcủa gen. Từ những ứng dụng đầu tiên của chúng, các phương pháp xây dựngthư viện gen (gene library) được hình thành và phát triển, và hiện nay đượcxem như là nền tảng cơ sở cho nhiều thí nghiệm hóa sinh và sinh học phântử. Mặc dù phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction-PCR) đểkhuếch đại gen cho phép phân tích gen nhanh hơn nhưng trong nhiều trườnghợp kỹ thuật tạo dòng gen vẫn còn hữu ích và là một yêu cầu tuyệt đối.Những phần dưới đây cung cấp một bức tranh tổng quát về các quá trình cơbản của công nghệ DNA tái tổ hợp.II. Phân lập đoạn DNA/gen Một số phương pháp phân lập gen để thực hiện kỹ thuật tái tổ hợpDNA đã được sử dụng là:Nhập môn Công nghệ sinh học 311. Tách các đoạn DNA từ genome Phương pháp này được thực hiện như sau: DNA hệ gen (genomicDNA) của một sinh vật được cắt thành các đoạn nhỏ dài khoảng 20 kb (kíchthước thích hợp tùy thuộc vào loại vector nhận chúng) bằng enzyme hạn chếrồi gắn vào vector để xây dựng thư viện genome (genomic library). Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae . Thông thư 4 bp, ví dụ như Mbo - - . (clone). .Nhập môn Công nghệ sinh học 32 (physical mapping).2. Sinh tổng hợp cDNA từ mRNA Đoạn DNA được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu mRNA được gọi làcDNA (complementary DNA). banhư sau: - . - - 2 (Mg2+ . - .mRNA-cDNA (khi tổng hợp sợi th E.coli (đ E. coli 5 . - 1. . Sợi đbacteriophage (cDNA library).3. Phân lập đoạn DNA bằng phương pháp PCR Ngoài hai phương pháp trên, hiện nay người ta sử dụng rất phổ biếnphương pháp PCR để phân lập một trình tự nucleotide (gen) từ genome củaNhập môn Công nghệ sinh học 33sinh vật dựa trên các primer đặc hiệu cho trình tự đó. Phương pháp PCR đơngiản và ít tốn thời gian hơn hai phương pháp trên, mà hiệu quả vẫn rất cao. Sinh tan tế bào và tinh sạch mRNA Mô (ví dụ: não) 5’ AAAAAA 3’ mRNA Gắn oligo(dT) primer 5’ AAAAAA 3’ mRNA Tổng hợp sợi cDNA thứ Reverse transcriptase nhất trên khuôn mẫu TTTTTT mRNA 5’ AAAAAA 3’ mRNA 3’ TTTTTT 5’ sợi cDNA thứ nhất Biến tính nhiệt và xử lý RNase H để phá hủy sợi mRNA TTTTTT 5’ Đầu 3’ của cDNA tạo thành vòng cặp tóc DNA polymerase I Tổng hợp sợi cDNA thứ hai AAAAAA 3’ TTTTTT 5’ Nuclease S1 5’ AAAAAA 3’ 3’ TTTTTT 5’ cDNA sợi đôi 2.1. PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh họchiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánhdấu một bưcác enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot (phân tích DNA).Nhập môn Công nghệ sinh học 34 in vitro đ - đ 20 nucleotide. ▪ Nguyên tắc của PCR Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ởvi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus tide (dAT ...