Chương 2: Kỹ thuật RFLP (Restriction fragment length polymorphisms)

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzim giới hạn. Khi ủ DNA với enzim giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp ở pH, nhiệt độ thích hợp sẽ sẽ tạo ra những phân đoạn DNA với kích thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ gen. Tham khảo chương hai "Kỹ thuật RFLP - Restriction fragment length polymorphisms" để hiểu hơn về vấn đề này.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chương 2: Kỹ thuật RFLP (Restriction fragment length polymorphisms) CHƯƠNGHAI KỸTHUẬTRFLP (RestrictionFragmentLengthPolymorphisms)I.GiớithiệuKỹthuậtRFLPlàkỹthuậtnghiêncứutínhđahìnhchiềudàicủacácphânđoạnDNAdựatrênđiểmcắtcácenzimgiớihạn(RestrictionEnzyme,RE).Khi ủDNAvớienzimgiớihạn ởdungdịchđệmthíchhợp ở pH,nhiệtđộ thíchhợpsẽ sẽ tạoranhữngphânđoạnDNAvớikíchthướckhácnhau,t ừ đólậpnêncácbảnđồgen.Kỹthuậtnàyđượcsửdụngphổbiếntừthậpniên80đếnnay.II.NguyêntắcchungNguyêntắccủakỹthuậtnàydựatrênđộ đặchiệucủacácenzimcắtgiớihạn (restrictionenzimRE)đốivớivị trínhậnbiếtcủachúngtrênDNAbộ gen.Sựkhácbiệtvịtrícắtgiữahaicáthểsẽtạoranhữngphânđoạncắtkhácnhau.III.Cácenzimgiớihạn(RE)1.Giớithiệu EnzimgiớihạnđượcWernerArbertìmthấy ở vikhuẩnvàonăm1962.ÔngchorằngcácREcókhả năngrấtđặcbiệtđólàkhả năngnhậnbiếtDNA chủ vàDNAlạ.Enzimnàyhạnchế sự nhânlêncủaDNAlạ khichúngxâm nhậpvàotếbàovikhuẩnbằngcáchcắtchúngrathànhtừngđoạnmộtcáchđặchiệu,vìthế ônggọilàrestrictioncónghĩalàhạnchế.Vớiphátminhnàyôngcùngcáccộngsự (DanielNathansvàHamiltonO.Smith)đãgiànhgiảithưởngNobelvàonăm1978. CácREhợpthànhhệ thốngbảovệ ở tếbàosơ hạch(procaryote),mộtcâuhỏiđặtralàvìsaocácREchỉ cắtDNAcủacácphagemàkhôngcắtDNA củatếbàovikhuẩn?CâutrảlờilànhờMethylaseđâylàenzimgiúpvikhuẩncó khảnăngnày,chínhenzimnàychịutráchnhiệmgắnnhómmetyl(CH 3)vàocácnucleotides ởvịtrícắtcủacácREtrênDNAcủavikhuẩnvìthế bảovệ DNAcủavikhuẩnkhỏisựphâncắtcủaRE.Tuyvậyđôilúcmethylaselạigắnnhằm cảnhómmetylvàochínhDNAcủaphage,điềunàygiảithíchvìsaođốivớicácdòngvikhuẩnkhángphagevẫncócáctếbàobịphânhủy. Enzimcắtgiớihạnđầutiênđượcphânlậpvàonăm1968,chođếnnay cókhoảng3.400REđượckhámphá.Trongsốnàycókhoảng540REđãđượcthươngmạihóa.2.TêngọicủaenzimcắtgiớihạnChữđầuviếthoalàchữđầutênvikhuẩntừđóREđượclytrích.Haichữ kế khôngviếthoatươngđươngvớitênloàicủavikhuẩn.Cả 3chữnầyđềuviếtinnghiêng.KếđếnlàchữsốlamãchỉthứtựREđượcpháthiện trongtrườnghợpnhiềuREđượctìmthấytrongcùngmộtvikhuẩn.Đôikhicòncóthêmchữviếthoa(viếtthẳng)đểchỉchủngvikhuẩnsửdụngVD:Escherichia coli Ry13 chi loài chủngEcoRI:làenzymđầutiêntìmthấytrênvikhuẩnE.coliEcoRV:enzymthứ5tìmthấytrênvikhuẩnE.coli3.CácloạienzimcắtgiớihạnLoạiI:khienzymnhậnbiếttrìnhtựnósẽdichuyểntrênphântửDNAcáchđó10005000nuvàgiảiphóngđộvàichụcnu.LoạiII:enzymnhậnbiếttrìnhtựvàcắtngayvịtríđó.LoạiIII:enzymnhậnbiếttrìnhtựvàcắtDNAởvịtrícáchđó20nu.III.QuytrìnhthựchiệnRFLPbaogồmcácbước: + TáchchiếtvàtinhsạchDNA + CắtcácmẫuDNAcầnphântíchbởiRE + PhântáchDNAtrêngelagarose + SouthernBlotting ChuyểnDNAsangmàngnylon Chọnđoạndò(probes),đánhdấuđoạndò Laighépgen(Hybridization) Lậpbảnđồgen(phântíchđahình) 1. TríchDNAa. Nguyêntắc:Thànhtếbàobịphávỡbằngbiệnphápcơhọcvàcácchấttẩy mạnh.DNAđượcgiảiphóngvàlàmsạchtạpchấtRnase.DNAđượckếttủatrong Ethanol100%vàthulạinhờlytâm.b. Quytrình: Thựchiệntheoquitrìnhđượcmô tả bởiRogersvàBendich(1988)(quitrìnhCTAB)gồmcácbướcsau: Lấylácủađốitượngcầnnghiêncứu.Khử trùngbề mặtlábằngcồn70%,sauđódùngkéovàkẹp(đãđượckhửtrùng)cắtláthànhtừngmảnhnhỏ rồichoriêngvàocáctuýp(mỗimẫuriêng mộttuýpkhoảng0,1g).Ngâmcáctuýpvàdụngcụnghiềnmẫuvàonitơlỏngtrong10phút.Chomẫuvàomáynghiền,cótầnsố27lần/giây,lậplạikhoảng3lần.Chothêm1.000µlExtractionbuffer(10mlEB+7µlβMercaptoethanol).Chothêm50µlSDS10%.Ủtrongnước65oCtrong30phút.Sau5phúttrởmặtmẫumộtlần.Lytâm13.000rpmtrong10phút.Lấy800µldịchtrongởtrênchovàotuýpmới(bỏphầncặn)Cho800µlIsopropanolvàomỗituýp,lắcđều.Ủmẫuở20oCtrong2giờ.Lytâm13.000rpmtrong10phút,bỏnước,lấycặn.Chothêm400µlTE0,1vào,thêm10µlRNase,ủ20phútở37oC.Cho400µlCTABvào,ủ15phútở65oC.Cho800µlChloroform/Isoamylalcohol,đảonhẹ(12mlChloroform:0,5mlIsoamylalcohol)Lytâm13.000rpmtrong5phút.Lấy700µlphầntrongchuyểnsangtuýpmới.Cho1,4mlEthanol96%làmlạnhvào,lắcnhẹ,để15phútởnhiệtđộphòng.Lytâm13.000rpmtrong10phút,bỏnước,lấycặn.Ch ...