Kỹ thuật di truyền-RFLP

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzim giới hạn (Restriction Enzyme, RE). Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu sau đây để nắm rõ hơn nội dung kiến thức cần thiết.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Kỹ thuật di truyền-RFLPKỹthuậtditruyềnRFLP KỸTHUẬTRFLP (RestrictionFragmentLengthPolymorphisms) a. GIỚITHIỆU Kỹ thuậtRFLPlàkỹ thuậtnghiêncứutínhđahìnhchiềudàicủacácphânđoạnDNAdựatrênđiểmcắtcácenzimgiớihạn(RestrictionEnzyme,RE).Khi ủDNAvớienzimgiớihạn ởdungdịchđệmthíchhợp ở pH,nhiệtđộ thíchhợpsẽsẽtạoranhữngphânđoạnDNAvớikíchthướckhácnhautrênlớpgelđiệndi,từđólậpnêncácbảnđồ gen.Kỹ thuậtnàyđượcsử dụngphổ biếntừ thậpniên80đếnnay. PhântíchRFLPcóthểđượcchiathànhmôhìnhthămdòvị tríđơn(SLP)và đa (MLP).Thôngthường,phươngphápSLPđượcdùngnhiềuhơnMLPvìnó nhạycảmhơn,dễ dàngđể giảithíchvàcókhả năngphântíchcácmẫuhỗnhợp DNA.Hơnnữa,dữ liệucóthể đượcđưarangaycả khiDNAbị suythoái(vídụnhưkhinóđượctìmthấytrongxương.) b. NGUYÊNTẮCCHUNG KĩthuậtRFLPdựatrênsự saikháccủaphổbăngđiệndivàđộ dàicủacác phânđoạnbị cắtbởienzymegiớihạn .Số lượngđoạncắtkhácnhauđượcphânbiệtbằngđiệndiđồ nêncònđượcgọilàdấuvântayđặctrưngchotừngphântửAND.KhixửlýcácmẫuDNAbằngcùngmộtenzymegiớihạnthìcáchệenzyme cócấutrúckhácnhausẽtạonêncácđoạncắtcóchiềudàikhácnhau.Ngượclại, nếucáchệenzymecócấutrúcgiốngnhausẽtạonêncácđoạncắtgiốngnhauvàthểhiệngiốngnhautrênđiệndiđồ. c. CÁCENZIMGIỚIHẠN(RE) d. Giớithiệu EnzimgiớihạnđượcWernerArbertìmthấyởvikhuẩnvàonăm1962.Ông chorằngcácREcókhả năngrấtđặcbiệtđólàkhả năngnhậnbiếtDNAchủ và DNAlạ.EnzimnàyhạnchếsựnhânlêncủaDNAlạ khichúngxâmnhậpvàotếbàovikhuẩnbằngcáchcắtchúngrathànhtừngđoạnmộtcáchđặchiệu,vìthếông Page|1KỹthuậtditruyềnRFLPgọilà restriction cónghĩalàhạnchế.Vớiphátminhnàyôngcùngcáccộngsự(DanielNathansvàHamiltonO.Smith)đãgiànhgiảithưởngNobelvàonăm1978. CácREhợpthànhhệthốngbảovệ ởtếbàonhânsơ (procaryote),mộtcâu hỏiđặtralàvìsaocácREchỉ cắtDNAcủacácphagemàkhôngcắtDNAcủatếbào vi khuẩn? Câu trả lời là nhờ Methylase đây là enzym giúp vikhuẩncókhả năngnày,chínhenzimnàychịutráchnhiệmgắnnhómmetyl(CH 3)vàocácnucleotides ở vị trícắtcủacácREtrênDNAcủavikhuẩnvìthế bảovệDNAcủavikhuẩnkhỏisự phâncắtcủaRE.Tuyvậyđôilúcmethylaselạigắn nhầmcảnhómmetylvàochínhDNAcủaphage,điềunàygiảithíchvìsaođốivớicácdòngvikhuẩnkhángphagevẫncócáctếbàobịphânhủy. Page|2KỹthuậtditruyềnRFLP Enzimcắtgiớihạnđầutiênđượcphânlậpvàonăm1968,chođếnnayđãpháttriểntớithế hệthứ3vớikhoảng3.400REđượckhámphá.Trongsố nàycókhoảng540REđãđượcthươngmạihóa. e. Têngọicủaenzimcắtgiớihạn ChữđầuviếthoalàchữđầutênvikhuẩntừđóREđượclytrích.Haichữkếkhôngviếthoatươngđươngvớitênloàicủavikhuẩn.Cả 3chữ nàyđềuviếtinnghiêng.Kế đếnlàchữ số lamãchỉ thứ tự REđượcpháthiệntrongtrườnghợpnhiềuREđượctìmthấytrongcùngmộtvikhuẩn.Đôikhicòncóthêmchữviếthoa(viếtthẳng)đểchỉchủngvikhuẩnsửdụng.Vídụ:EcoRI:làenzymđầutiêntìmthấytrênvikhuẩnE.Coli EcoRV:enzymthứ5tìmthấytrênvikhuẩnE.coli f. CácloạienzimcắtgiớihạnLoạiI:khienzymnhậnbiếttrìnhtự nósẽ dichuyểntrênphântử DNAcáchđó 10005000nuvàgiảiphóngđộvàichụcnu.LoạiII:enzymnhậnbiếttrìnhtựvàcắtngayvịtríđó.LoạiIII:enzymnhậnbiếttrìnhtựvàcắtDNAởvịtrícáchđó20nu. Page|3KỹthuậtditruyềnRFLP g. QUYTRÌNHTHỰCHIỆNKỸ THUYẬTRFLPBAOGỒMCÁC BƯỚC:TáchchiếtvàtinhsạchDNACắtcácmẫuDNAcầnphântíchbởiREPhântáchDNAtrêngelagaroseSouthernBlotting: +ChuyểnDNAsangmàngnylon +Chọnđoạndò(probes),đánhdấuđoạndò +Laighépgen(Hybridization) +Lậpbảnđồgen(phântíchđahình) Page|4KỹthuậtditruyềnRFLP h. TríchDNA i. Nguyêntắc: Thànhtếbàobịphávỡbằngbiệnphápcơ họcvàcácchấttẩymạnh.DNA đượcgiảiphóngvàlàmsạchtạpchấtRnase.DNAđượckếttủatrongEthanol 100%vàthulạinhờlytâm. j. Quytrình: ThựchiệntheoquitrìnhđượcmôtảbởiRogersvàBendich(1988)(quitrình CTAB)gồmcácbướcsau: ...