Chương 5: PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA mạch khuôncần sự hiện diện của mồi chuyên biệt.Mồi: đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu củamạch khuôn.Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % DNA mạchđôi bị tách mạch thành mạch đơn). Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °CNếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổsung với 2 đầu của một trình tự DNA, DNA polymerase sẽ xúc táctổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chương 5: PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Chương 5 PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)1. Nguyên tắc của phương pháp PCR:DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA mạch khuôn cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt.Mồi: đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn.Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % DNA mạch đôi bị tách mạch thành mạch đơn). Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °CNếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ sung với 2 đầu của một trình tự DNA, DNA polymerase sẽ xúc tác tổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi.2. Phản ứng PCR: Thành phần phản ứng: - DNA bản mẫu - Mồi xuôi và mồi ngược - dNTP (gồm 4 loại: dATP, dGTP, dTTP, dCTP) - MgCl2 - Enzyme polymerase (Taq polymerase, Pfu…) - Dung dịch đệm. - Nước cất 2 lần (đã khử trùng) Các bước của phản ứng: Là một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1: Biến tính (denaturation) DNA được biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 – 950C,trong thời gian 30s – 1 phút. Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization) Nhiệt độ cần cho sự bắt cặp mồi với DNA mạch khuôn là Ta(Ta thấp hơn Tm khoảng 50C). Bước 3: Kéo dài (elongation) Nhiệt độ được tăng lên đến 720C, để DNA polymerase hoạtđộng kéo dài mạch.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR DNA mẫu:- DNA sạch, lượng DNA sử dụng cho PCR có khuynh hướng giảm (khoảng 100 ng)- Giảm lượng mẫu  hạn chế sản phẩm “kí sinh”.- PCR có thể thực hiện trên các mẫu không được bảo quản tốt. Enzyme :- Enzyme polymerase đầu tiên chịu nhiệt được tách chiết từ Thermus aquaticus là Taq polymerase.- Enzyme Pfu DNA polymerase thu nhận từ vi khuẩn Pyroccus furiosus có khả năng chịu nhiệt cao hơn, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease.- Tth polymerase, tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng phiên mã ngược khi có RNA và Mn2+, khi có DNA và Mg2+ thì enzyme này thực hiện khuếch đại DNA. Mồi và nhiệt độ lai Ta Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Khi thiết kế mồi cần chú ý: thành phần GC, khả năng bắt cặp bổ sung giữa “mồi xuôi” và “mồi ngược”, khả năng tạo cấu trúc “kẹp tóc”. Tm của 2 mồi không cách biệt quá xa. Mồi đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại và không bắt cặp với trình tự khác trên gen. Các thành phần khác của phản ứng: dNTP: thường sử dụng ở nồng độ là 20 -200 µM đối với mỗi loại. Mg2+: quá ít  hiệu quả nhân bản giảm quá nhiều  tạo sản phẩm không đặc hiệu Số lượng chu kỳ: không vượt quá 404. Ứng dụng của phương pháp PCR- Tạo số lượng lớn bản sao DNA  dòng hóa gene, giải trình tự, lập bản đồ di truyền, sản xuất mẫu dò…- Biến đổi một trình tự DNA: thêm vị trí của enzyme cắt hạn chế, gây tạo đột biến trên DNA, thêm trình tự promoter, trình tự gắn của ribosome…5. Hạn chế của phương pháp PCR- Ngoại nhiễm:Xử lí: Khử trùng khu vực thao tác . Việc thiết lập phản ứng PCR và phân tích sản phẩm được tiến hành ở các khu vực khác nhau.- Nhân bản không đặc hiệu:- Các sai sót do Taq polymerase5. Các dạng khác của PCR:- RT –PCR (reverse transcriptase –PCR): RNA  cDNA  DNA.- RT – PCR (Realtime PCR – PCR định lượng): xác định hàm lượng sản phẩm PCR tạo ra ở từng thời điểm. Nguyên tắc: xác định hàm lượng sản phẩm dựa trên tín hiệu huỳnh quang.- PCR nested: sử dụng nhiều hơn một cặp mồi  thu nhận sản phẩm đặc hiệu hơn.