TÀI LIỆU TẬP HUẤN KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM CÁ

Hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử phần lớn là những chất độc hại vì thế, luôn xem kỹ tên hóa chất trước khi sử dụng và cần ghi chú rõ ràng bên ngoài bao bì mỗi loại hóa chất.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
TÀI LIỆU TẬP HUẤN KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM CÁ Viện Nghiên Cứu Và Nuôi Trồng Thủy Sản II Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc, Cảnh Báo Môi Trường Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ TÀI LIỆU TẬP HUẤN KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM CÁ Lưu hành nội bộ Tp. Hồ Chí Minh 2007 1 CHƯƠNG I: LÝ THUYẾT PHÒNG THÍ NGHIỆM I. AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM Luôn mặc quần áo bảo hộ trong khi làm việc tại phòng thí nghiệm. 1. Hóa chất Hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử phần lớn là những chất độc hại vì thế, luôn xem kỹ tên hóa chất trước khi sử dụng và cần ghi chú rõ ràng bên ngoài bao bì mỗi loại hóa chất. Trước khi sử dụng một loại hóa chất mới, cần phải tham khảo thông tin c ủa chúng t ừ các tài liệu của nhà sản xuất. Ví dụ: Phenol – rất dễ gây cháy Acrylamide – tác động độc lên hệ thần kinh Ethidium bromide – tác nhân gây ung thư Luôn đeo găng tay khi làm việc với các hóa chất và không bao giờ được hút chúng bằng miệng. Nếu tiếp xúc trực tiếp với những chất độc này phải nhanh chóng rửa vùng tiếp xúc dưới vòi nước và tuân theo chỉ dẫn của người hướng dẫn. Các hóa chất cần phải được bảo quản đúng nhiệt độ quy định: nhiệt độ phòng, trong tủ mát (40C) hoặc tủ lạnh âm (-200C) và được ghi nhãn cẩn thận. 2. Đèn tử ngoại (UV) Tiếp xúc trục tiếp với tia UV có thể gây hại mắt. Luôn luôn đeo kính bảo vệ khi s ử dụng đèn UV. 3. Nguồn điện Điện thế sử dụng trong quá trình điện di có thể gây giật điện. Đậy nắp bồn điện di trong suốt quá trình điện di để tránh bị điện giật. Luôn tắt nguồn điện trước khi lấy bản gel ra khỏi bồn điện di. 4. Các vật dụng Vật dụng thủy tinh và nhựa dùng trong sinh học phân tử phải sạch và vô trùng. Ống nghiệm bẩn như nhiễm khuẩn hoặc dính các chất tẩy đều có thể ức chế phản ứng hoặc làm hỏng vật liệu di truyền (nucleicacid). Vật dụng thủy tinh (ống nghiệm, bình tam giác…) tốt nhất cần được rửa bằng nước cất, hấp thanh trùng hoặc sấy 1500C trong vòng 1 giờ. Đối với thí nghiệm liên quan RNA, vật dụng thủy tinh cần được xử lý bằng diethyl-pyrocarbonate để ức chế enzyme RNases là một loại enzyme rất bền đối với việc hấp thanh trùng. Vật dụng nhựa (pipets và ống nuôi cấy, ống nghiệm nhỏ…) cần được thanh trùng trước khi sử dụng. 2 5. Rác thải và hóa chất thừa Ethidium bromide là một tác nhân gây ung thư vì thế khi thao tác với những vật dụng có dính chất này cần phải đeo găng tay bảo hộ. Gel agarose có chứa Ethidium bromide cần phải được vứt bỏ trong một túi riêng có đánh dấu. Quy định túi rác cho từng khu vực, từng công đoạn Hóa chất nguy hiểm cần có túi để riêng II. PHA CHẾ DUNG DỊCH Nồng độ mole, % và dung dịch mẹ X. Nồng độ mole Dung dịch có nồng độ mole 1 M là một dung dịch có thể tích 1 lít và chứa số gram hóa chất tương đương với trong lượng phân tử của chất đó. Ví dụ: Chuẩn bị 100ml dung dịch NaCl 5M (trọng lượng phân tử: 58.456 đvc) Cân 29.29 g NaCl (cách tính: 58.456 g/mol x 5 moles/lít x 0.1 lít) Pha trong 100ml nước cất hoặc dung dung môi. Nồng độ phần trăm: Nồng độ phần trăm (trong lượng/thể tích) = trọng lượng chất tan (g) pha trong 100 ml nước cất hoặc dung dung môi. Ví dụ: Chuẩn bị dung dịch agarose 0.7% trong đệm điện di TBE Cân 0.7 g agarose Thêm dung dịch TBE 1X sao cho thể tích cuối cùng là 100ml. Dung dịch mẹ X. Nhiều loại hóa chất, dung dịch cần được chuẩn bị ở nồng độ cao (dung dịch mẹ) 5 lần (5X) hoặc mười lần (10X) so với nồng độ cần thiết khi sử dụng. Trước khi sử dụng chúng sẽ được pha loãng thích hợp để đưa về nồng độ cần thiết (1X của dung dịch làm việc). Ví dụ: Chuẩn bị dung dịch điện di TBE 1X: 100ml dung dịch TBE 10X Thêm 900ml nước cất để thể tích cuối cùng là 1000 ml dung dịch TBE 1X. Chuẩn bị dung dịch làm việc từ dung dịch mẹ Nhiều dung dịch trong nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đòi hỏi sử dụng cùng một thành phần hóa chất nhưng lại khác nhau về nồng độ. Vì thế để tránh ph ải ph ức tạp khi pha chế riêng rẽ các hóa chất này chúng ta tốt nhất nên chuẩn bị s ẵn một vài dung dịch gốc để dễ dàng pha loãng chúng khi cần thiết. Ví dụ: có thể pha đệm TBE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) bằng cách phối hợp 1ml dung dịch Tris 1M và 2 ml dung dịch EDTA 0.5 M cộng với 98.8 ml nước cất vô trùng. Công thức chung dùng để tính toán nồng độ cần thiết như sau: 3 Ci x Vi = Cf x Vf C i = nồng độ ban đầu, hoặc nồng độ của dung dịch mẹ; V i = thể tích ban đầu, hoặc lượng dung dịch mẹ cần thiết, C f = nồng độ cuối, hoặc nồng độ mong muốn sau khi pha; V f = thể tích cuối, hoặc thể tích mong muốn sau khi pha III. SỬ DỤNG THIẾT BỊ Yêu cầu học viên giữ gìn các vật dụng trong phòng thí nghiệm cẩn thận. Không được tự ý sử dụng các thiết bị khi chưa được sự đồng ý hoặc chưa được hướng dẫn sử dụng của người hướng dẫn. Không di dời dụng cụ, thiết bị từ khu vực này đến khu vực khác mà chưa có ý kiến của người hướng dẫn Thông báo ngay bất kỳ hỏng hóc của thiết bị. Máy ly tâm Khi ly tâm, cần phải cân bằng rotor trước khi ly tâm. Lau chùi rotor của máy ly tâm sau khi sử dụng nếu bị vấy bẩn Đậy nắp máy ly tâm khi sử dụng xong. Micropipettors Mỗi pipette đều có giới hạn thể tích do vậy cần phải kiểm tra giới hạn thể của từng pipette trước khi sử dụng. Không được điều chỉnh pipette quá mức giới hạn. Không để rơi pipette xuống đất. IV. NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG PCR TRONG CHẨN ĐOÁN PCR là phản ứng nhân tạo tổng hợp và khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai trình tự gọi là mồi (primer). Mồi (pri ...