Chuyển gien mã hóa Enzym mở xoắn AND (PDh45) vào cây thuốc lá (Nicotianna Tabacum L. cv Xanthi) qua Agrobacterium và phân tích các cây được chuyển gien

Bài viết tìm hiểu vai trò sinh lý của Enzym PDH45 trong quá trình sinh trưởng phát triển của thực vật, nghiên cứu chuyển gien PDH45 theo cả hai hướng có nghĩa và đối nghĩa sử dụng cây thuốc là làm mô hình thử nghiệm.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chuyển gien mã hóa Enzym mở xoắn AND (PDh45) vào cây thuốc lá (Nicotianna Tabacum L. cv Xanthi) qua Agrobacterium và phân tích các cây được chuyển gien25(3): 83-92 T¹p chÝ Sinh häc 9-2003 ChuyÓn gien m hãa enzym më xo¾n ADn (PDH45) vµo c©y thuèc l¸ (Nicotiana tabacum L. cv Xanthi) qua Agrobacterium Vµ PH¢N TÝCH C¸C c©y ®−îc CHUYÓN GiEN ph¹m xu©n héi, trÇn duy quý ViÖn Di truyÒn n«ng nghiÖp phan tuÊn nghÜa Tr−êng ®¹i häc Khoa häc tù nhiªn, §HQGHN Narendra Tuteja Trung t©m Kü thuËt gien vµ C«ng nghÖ sinh häc quèc tÕ Víi chøc n¨ng xóc t¸c viÖc më xo¾n ADN Clonetech. C¸c chÊt kh¸ng sinh vµ hãa chÊt sösîi ®«i ®Ó t¹o ra hai sîi ®¬n, ADN helicaza ®ãng dông trong c¸c thÝ nghiÖm cña hFng Promega,vai trß quan träng trong tÊt c¶ mäi ho¹t ®éng Sigma, Serva, USB. ThÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnhtrao ®èi chÊt ADN. RÊt nhiÒu ADN helicaza cña t¹i TTKTG&CNSHQT, Niu §eli.c¸c c¬ thÓ kh¸c nhau nh− vi khuÈn, thùc khuÈnthÓ, nÊm men, ®éng vËt cã vó vµ con ng−êi ®F 2. Ph−¬ng ph¸p®−îc ph¸t hiÖn, nghiªn cøu ®Æc tÝnh vµ x¸c ®Þnh a) CÊu tróc cña c¸c vect¬ t¸i tæ hîp mang gienchøc n¨ng cña chóng. GÇn ®©y, gien m¨ hãa cho pdh45 theo c¶ h−íng cã nghÜa vµ ®èi nghÜamét ADN helicaza (PDH45) cña c©y ®Ëu HµLan, lµ gien helicaza ®Çu tiªn cña giíi thùc vËt, Vect¬ pBI121 ®−îc sö dông cho viÖc chuyÓncòng ®F ®−îc ph©n lËp vµ nghiªn cøu ®Æc tÝnh. gien pdh45 vµo thuèc l¸ theo c¶ hai h−íng cãC¸c nghiªn cøu ho¹t tÝnh enzym ®F chøng minh nghÜa vµ ®èi nghÜa. PhÇn tr×nh tù ADN mF hãaPDH45 lµ mét protein quan träng víi nhiÒu cña gien pdh45 ®−îc nh©n lªn b»ng PCR söchøc n¨ng nh− tham gia vµo qu¸ tr×nh sinh tæng dông måi ®Çu 5 mang bé ba khëi ®Çu vµ tr×nh tùhîp protein, duy tr× c¸c ho¹t ®éng c¬ b¶n cña tÕ nhËn mÆt cña NdeI vµ måi ®Çu 3 mang bé babµo vµ kÝch thÝch häat ®éng cña topoisomeraza I kÕt thóc vµ tr×nh tù nhËn mÆt cña XbaI. S¶n[11]. Trong c«ng tr×nh nµy, víi môc ®Ých ®i s©u phÈm cña ph¶n øng PCR ®−îc g¾n vµo vect¬t×m hiÓu vai trß sinh lý cña enzym PDH45 trong pGEM-T Easy, sau chuyÓn vµo tÕ bµo kh¶ biÕnqu¸ tr×nh sinh tr−ëng ph¸t triÓn cña thùc vËt, E. coli DH5α ®Ó nh©n lªn plasmit t¸i tæ hîp.chóng t«i ®F tiÕn hµnh c¸c nghiªn cøu chuyÓn Plasmit t¸i tæ hîp ®−îc c¾t bëi EcoR I sau phÇngien pdh45 theo c¶ hai h−íng cã nghÜa (sense) mF hãa gien pdh45 ®−îc g¾n vµo vect¬vµ ®èi nghÜa (antisense) sö dông c©y thuèc l¸ pBluescript ®F ®−îc c¾t b»ng EcoR I. PhÇn mFlµm m« h×nh thö nghiÖm. hãa gien pdh45 trong vect¬ pBluescript l¹i ®−îc t¸ch ra b»ng c¸ch c¾t vect¬ víi XbaI vµ sau ®ã I. ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu l¹i g¾n vµo vect¬ pBI121 ®−îc c¾t b»ng cïng enzym. S¶n phÈm g¾n ®−îc chuyÓn vµo tÕ bµo1. VËt liÖu kh¶ biÕn E. coli DH5α vµ nu«i trªn m«i tr−êng Gièng thuèc l¸ Nicotiana tabacum cv xanthi LB chøa 50µg/ml kanamyxin. PhÇn mF hãa giendo Trung t©m Kü thuËt gien vµ C«ng nghÖ sinh pdh45 g¾n vµo vect¬ pBI121 theo h−íng cãhäc quèc tÕ (TTKTG&CNSHQT) cung cÊp. nghÜa vµ ®èi nghÜa ®−îc ph©n biÖt b»ng c¸ch c¾tChñng vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens plasmit t¸i tæ hîp (pBI121-PDH45) bëi HindIIILBA-4404 ®Æt mua tõ hFng Novagen. Vect¬ vµ ph©n tÝch s¶n phÈm c¾t trªn gel agarosachuyÓn gien thùc vËt pBI121 cña hFng 0,9%. 83b) ChuyÓn phÇn tr×nh tù mG hãa gien pdh45 vµo vµo ng©m tõ 5-10 phót. C¸c mÉu l¸ thuèc l¸ chñng vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens ®−îc lµm kh« bëi giÊy thÊm, sau chuyÓn sang LBA 4404 nu«i ë m«i tr−êng t¸i sinh (c¬ b¶n MS, 1 mg/l Plasmit t¸i tæ hîp pBI121-PDH45 theo c¶ BAP vµ 0,1 mg/l NAA) kh«ng chøa kanamyxin.h−íng cã nghÜa vµ ®èi nghÜa ®−îc chuyÓn vµo ®) Chän läc, t¸i sinh vµ sinh tr−ëng cña c¸c c©ychñng vi khuÈn LBA 4404 theo ph−¬ng ph¸p chuyÓn gienlµm ®«ng l¹nh-lµm tan nh− m« t¶ cña Horsch vµcs. [5]. Sau 2-3 ngµy cïng nu«i cÊy trong m«i tr−êng t¸i sinh kh«ng chøa kanamyxin, c¸c mÉuc) ChuÈn bÞ mÉu thuèc l¸ cho viÖc chuyÓn gien thuèc l¸ ®−î ...