Đánh giá bất thường cô đặc nhiễm sắc thể tinh trùng bằng nhuộm aniline blue

Mục đích nghiên cứu của bài viết nhằm thử nghiệm nhuộm aniline blue (AB) đánh giá mức độ cô đặc nhiễm sắc thể (NST) tinh trùng. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết tài liệu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Đánh giá bất thường cô đặc nhiễm sắc thể tinh trùng bằng nhuộm aniline blueTẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017ĐÁNH GIÁ BẤT THƢỜNG CÔ ĐẶC NHIỄM SẮC THỂ TINH TRÙNGBẰNG NHUỘM ANILINE BLUENguyễn Thanh Hoa*; Phan Nữ Thục Hiền*TÓM TẮTMục tiêu: thử nghiệm nhuộm aniline blue (AB) đánh giá mức độ cô đặc nhiễm sắc thể (NST)tinh trùng. Đối tượng và phương pháp: 40 mẫu tinh dịch chất lượng bình thường theo tiêuchuẩn WHO (2010). Tiến hành nhuộm AB đánh giá mức độ cô đặc NST. Xem xét mối liên quangiữa mức độ cô đặc NST tinh trùng và hình thái tinh trùng. Kết quả: nhuộm AB cho hình ảnhtinh trùng bất thường cô đặc NST có đầu bắt màu thuốc nhuộm, tinh trùng bình thường cô đặcNST không bắt màu thuốc nhuộm. Không có mối liên quan giữa bất thường hình thái và bấtthường cô đặc NST tinh trùng. Kết luận: có thể sử dụng nhuộm AB đánh giá mức độ cô đặcNST tinh trùng như một xét nghiệm độc lập không liên quan đến hình thái tinh trùng.* Từ khóa: Cô đặc nhiễm sắc thể tinh trùng; Nhuộm aniline blue; Hình thái tinh trùng.Assessment of Mature Sperm by Aniline Blue StainSummaryObjectives: Aniline blue stain test evaluated sperm chromatin condensation or spermnucleus maturity. Subjects and methods: 40 semen samples with normal quality semenaccording to WHO 2010 standard. Using AB stain to evaluate chromatin condensation sperm.Assess the relationship between abnormal chromatin condensation and abnormal spermmorphology. Results: Abnormal chromatin condensation sperms (immature chromatin sperms)had blue-stained nucleus, normal chromatin condensation (mature sperm) had unstainednucleus. There is no correlation between sperm morphology and sperm maturity. Conclusion:AB stain can be used to assess sperm chromatin condensation as an independent test thatdoes not involve sperm morphology.* Keywords: Sperm chromatin condensation; Aniline blue stain; Morphology sperm.ĐẶT VẤN ĐỀVô sinh nam chiếm một nửa nguyênnhân gây vô sinh nói chung. Tinh dịch đồ làxét nghiệm đầu tiên được chỉ định để chẩnđoán nguyên nhân vô sinh nam nhưngkhông đánh giá được hết khả năng sinhsản của nam giới. Trong quá trình sinh tinh,đóng gói hay cô đặc NST tinh trùng nhằmbảo vệ vật chất di truyền, đảm bảo chứcnăng sinh sản của tinh trùng. Quá trình nàygồm có sự thay đổi các histone trong ADNbằng biến thể histone, sau đó là proteinchuyển tiếp và cuối cùng là protamine [1].Nhiều nghiên cứu chỉ ra bất thường ADNtinh trùng gặp nhiều hơn ở nam giới vô sinhvà liên quan đến sảy thai tự phát cũng nhưthất bại trong hỗ trợ sinh sản.* Trường Đại học Y Hà NộiNgười phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thanh Hoa (thanhhoa.mophoi@gmail.com)Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017Ngày bài báo được đăng: 30/08/201787TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017Các phương pháp đánh giá bất thườngvề ADN như SCSA (Sperm chromatinstructure assay), TUNEL (Terminaldeoxynucleotidyl transferase dUTP nickend labling), phương pháp phân tích saochổi (Comet assay) hay các dấu ấn sinhhọc... trang thiết bị phức tạp, chi phí cao,khó áp dụng rộng r i trong điều kiệnViệt Nam hiện nay. Trong khi đó, nhuộmAB là phương pháp có thể đánh giá đượcmức độ hoàn thiện trong khâu đóng góiADN tinh trùng, dễ thực hiện, giá thànhrẻ. Nguyên lý của phương pháp này dựatrên việc AB phản ứng với lysine nên cóthể phân biệt được sự khác biệt trongthành phần protein nhân cơ bản của tinhtrùng. Nhân tinh trùng chưa trưởng thànhhay bất thường về cô đặc NST rất giàuhiston chứa hàm lượng lysine phong phúnên bắt màu thuốc nhuộm xanh da trời.Ngược lại, nhân tinh trùng trưởng thànhgiàu protaime có hàm lượng lysine rấtthấp không bắt màu AB.Trên thế giới, các nghiên cứu vẫn cònnhiều tranh cãi về tương quan giữa tỷ lệtinh trùng bất thường ngưng tụ NST vàcác thông số khác của tinh dịch đồ [2, 3].Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào ứngdụng phương pháp này. Do đó, chúng tôitiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Thửnghiệm nhuộm AB và bước đầu đánh giámối liên quan giữa bất thường cô đặc NSTcủa tinh trùng bằng nhuộm AB và hình tháitinh trùng.ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Đối tượng nghiên cứu.40 mẫu tinh dịch có chất lượng bìnhthường theo tiêu chuẩn WHO (2010).882. Phương pháp nghiên cứu.Nghiên cứu mô tả cắt ngang.* Kỹ thuật:- Lấy mẫu: mẫu tinh dịch được bệnhnhân (BN) tự lấy bằng phương pháp thủdâm, đựng trong cốc chuyên dụng khôngđộc với tinh trùng. Sau lấy, để trong tủ ấm37°C đợi tinh dịch ly giải hoàn toàn.- Đánh giá chất lượng tinh dịch trướcnhuộm. Lựa chọn các mẫu chất lượng bìnhthường theo tiêu chuẩn WHO (2010).- Đánh giá bất thường về hình tháitheo từng đặc điểm: nhuộm lam hình tháitheo quy trình thường quy. Đánh giá hìnhthái của 200 tinh trùng dưới vật kính dầuđộ phóng đại x 1.000 lần. Tính tỷ lệ % từngloại bất thường, gồm bất thường đầu,bất thường cổ, bất thường đuôi và bấtthường chung.- Đánh giá bất thường cô đặc NST củatinh trùng bằng AB: nhỏ 10 μl mẫu tinhdịch lên lam kính, dùng lam khác kéo làmlam đàn; để khô trong nhiệt độ phòng; cốđịnh bằng nhỏ PFA 4% trong 30 phút; rửabằng PBS 0,1 M x 2 lần. Nhỏ 10 μl AB 5%trong dung dịch axít acetic 4% (pH 3.5)phủ kín lam đàn. Để trong vòng 5 phút;rửa sạch bằng PBS 0,1 M x 2 lần; để khôở nhiệt độ phòng.- Đánh giá bất thường cô đặc NST tinhtrùng bằng kính hiển vi quang học, đếm200 tinh trùng sử dụng vật kính dầu độphóng đại x 1.000 lần:+ Tinh trùng chưa trưởng thành có phầnđầu bắt màu xanh đậm của AB.TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017+ Tinh trùng bán trưởng thành có phầnđầu vẫn bắt màu thuốc nhuộm chiếm < 50%diện tích đầu.+ Tinh trùng trưởng thành đầu khôngbắt màu.Bảng 1: Đặc điểm chung vi thể tinh dịchđồ nghiên cứu.Đặc điểm* Chỉ tiêu nghiên cứu:Mật độ (triệu/ml)- Tỷ lệ tinh trùng bất thường đầu.Di độngGiá trị Giá trịlớnnhỏnhấtnhấtTrung bình( X ± SD)2102072,18 ± 36,42- Tỷ lệ tinh ...